Endoteliale Kolonidannende Celler hos Patienter med VWD, AVWS og Raske Personer (ECFCs/2022)

Studiet har til formål at etablere en referencepopulation af endoteliale kolonidannende celler (ECFC'er) fra raske personer og sammenligne dem med ECFC'er fra patienter med VWD/AVWS.

Denne sammenligning vil bidrage til at identificere cellulære og molekylære ændringer, der ligger til grund for kvalitative og kvantitative VWF-defekter. Resultaterne vil blive korreleret med kliniske og biokemiske data for at klarlægge sygdomsmekanismer.

Studiedesign: Dette er en national, monocentrisk, ikke-farmakologisk undersøgelse fremmet af Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico og koordineret af SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Indskrivning: Patienter med en tidligere diagnose af VWD eller AVWS henvist til Angelo Bianchi Bonomi Hæmofili og Trombose Center vil blive kontaktet til planlagt indskrivning. Historiske kliniske, biokemiske og molekylære data vil blive gennemgået, informeret samtykke indhentet, og en undersøgelsesspecifik blodprøve indsamlet for at bekræfte VWF-niveauer og isolere ECFC'er.

Raske frivillige uden tidligere blødnings- eller tromboselidelser vil blive indskrevet i et antal svarende til patientgruppen. Efter et kort sundhedsinterview og informeret samtykke vil de gennemgå samme blodindsamlingsprocedure som patienterne.

Prøveindsamling:

Deltagere vil blive underkastet blodprøvetagning til følgende procedurer:

• Otte milliliter plasma i natriumcitrat vil blive aliquotteret og opbevaret ved -80 °C. Disse prøver vil blive brugt til at bekræfte patienters diagnoser og, for kontroller, til at måle VWF-niveauer.
• Genetisk analyse: et citratrør vil blive indsamlet for medfødte patienter uden tidligere molekylær karakterisering.
• I alt 50 ml blod i lithiumheparin vil blive taget til ECFC-isolering efter den tidligere publicerede protokol. Isoleringsproceduren vil blive udført inden for 3 timer efter prøveindsamling. Ved mislykket isolering kan deltagerne blive bedt om en anden og sidste blodprøvetagning.

Plasmaprøvetestning fælles for alle indskrevne: Alle indskrevne vil gennemgå standard plasmatestning, inklusive VWF-antigen, FVIII-aktivitet, VWF-aktivitet (VWF:RCo eller VWF:GPIbR), VWF kollagen-bindingsaktivitet og VWF propeptid.

Lavopløsnings VWF multimeranalyse vil blive udført ved hjælp af enten den interne metode eller det semiautomatiserede system.

Procedure, der skal udføres på ECFC'er (fælles for alle indskrevne):

• ECFC-isolering vil følge en modificeret version af protokollen af Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Flowcytometri vil blive udført for at bekræfte endoteliel linje.
• Konfokal immunofluorescensmikroskopi vil blive udført ved at plade ECFC'er på glasplader belagt med rottehale kollagen type I. Udvalgte markører vil inkludere DAPI til celleskærne, VWF og andre endotelielle markører.
• Basal og stimuleret VWF-sekretion (efter histamin- eller PMA-eksponering) vil blive vurderet ved måling af VWF:Ag-niveauer i kulturmedier og cellelysater ved hjælp af en intern ELISA.
• VWF multimeranalyse vil blive udført ved hjælp af samme procedure anvendt på plasmaprøver.
• RNA-ekspressionsanalyse vil inkludere RNA-isolering, førstestrangs cDNA-syntese og kvantitativ realtids-PCR for VWF og yderligere markører ved hjælp af foruddesignede TaqMan® assays (ThermoFisher Scientific), normaliseret til GAPDH eller andre huske-gener.

Assay begrænset til ECFC'er isoleret fra gruppe B-patienter og udvalgte kontroller:

Angiogeneseassay vil blive udført ved hjælp af Matrigel (Corning). ECFC'er fra raske frivillige vil blive brugt til at etablere assay-betingelserne og vil tjene som reference til analysen af ECFC'er isoleret fra patienter.

Assay begrænset til ECFC'er isoleret fra gruppe C og udvalgte kontroller: undergruppestudie:

Hæmning af den mutante allel ved hjælp af small interfering RNA (siRNA) vil blive udført på en patient udvalgt baseret på den specifikke genetiske defekt (type 2A-mutation). ECFC'er fra denne patient vil blive transfekteret med en tilpasset siRNA rettet mod den mutante allel, mens en kommerciel VWF-specifik siRNA og en negativ kontrol-siRNA vil blive brugt som kontroller på både type 2A-ECFC'er og ECFC'er fra raske frivillige. Alle ECFC-procedurer vil blive gentaget efter siRNA-silencing, og resultaterne vil blive sammenlignet med dem opnået fra raske kontrol-ECFC'er.

Dataanalyse Kontinuerte variable vil blive rapporteret som median og interkvartilområde, mens kategoriske variable vil blive præsenteret som antal og procenter. Laboratorieresultater vil blive udtrykt som gennemsnit og standardafvigelse. Sammenligninger vil blive udført ved hjælp af one-way ANOVA eller Kruskal-Wallis tests, afhængigt af om variable følger en normal eller ikke-normal fordeling. En p-værdi <0,05 vil blive betragtet som statistisk signifikant.

Korrelationsanalyser mellem VWF mRNA-ekspressionsniveauer og VWF sekret i cellemedier, cellelysater og tilsvarende plasma VWF-niveauer vil blive udført ved hjælp af Pearson's eller Spearman's rangkorrelation, som passende.

Når tilgængeligt, vil analyser blive udført ved hjælp af mere end en ECFC-klon fra hver indskreven.