Endoteliale kolonidannende celler hos pasienter med VWD, AVWS og friske personer (ECFCs/2022)
Isolasjon og karakterisering av endoteliale kolonidannende celler (ECFCer) hos pasienter diagnostisert med Von Willebrands sykdom, ervervet Von Willebrand syndrom og friske individer
Studieoversikt
Status
Detaljert beskrivelse
Studien har som mål å etablere en referansepopulasjon av endoteliale kolonidannende celler (ECFC-er) fra friske forsøkspersoner og sammenligne dem med ECFC-er fra pasienter med VWD/AVWS.
Denne sammenligningen vil bidra til å identifisere cellulære og molekylære endringer som ligger til grunn for kvalitative og kvantitative VWF-defekter. Funn vil bli korrelert med kliniske og biokjemiske data for å avklare sykdomsmekanismer.
Studiedesign: Dette er en nasjonal, monosentrisk, ikke-farmakologisk studie fremmet av Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico og koordinert av SC Medicina - Emostasi e Trombosi.
Inkludering: Pasienter med tidligere diagnose av VWD eller AVWS henvist til Angelo Bianchi Bonomi Hemofili og Trombose Senter vil bli kontaktet for planlagt inkludering. Historiske kliniske, biokjemiske og molekylære data vil bli gjennomgått, informert samtykke vil bli innhentet, og en studie-spesifikk blodprøve vil bli tatt for å bekrefte VWF-nivåer og isolere ECFC-er.
Friske frivillige uten historie om blødnings- eller tromboselidelser vil bli inkludert i et antall som tilsvarer pasientgruppen. Etter et kort helseintervju og informert samtykke, vil de gjennomgå de samme blodprøveprosedyrene som pasientene.
Prøvetaking:
Deltakere vil gjennomgå blodprøvetaking for følgende prosedyrer:
- Åtte milliliter plasma i natriumcitrat vil bli aliquotert og lagret ved -80 °C. Disse prøvene vil bli brukt til å bekrefte pasienters diagnoser og, for kontroller, til å måle VWF-nivåer.
- Genetisk analyse: ett citratrør vil bli samlet for medfødte pasienter uten tidligere molekylær karakterisering.
- Totalt 50 ml blod i litiumheparin vil bli tatt for ECFC-isolering i henhold til tidligere publisert protokoll. Isoleringsprosedyren vil bli utført innen 3 timer etter prøvetaking. Ved mislykket isolering kan deltakere bli bedt om å gjennomgå en andre og siste blodprøvetaking.
Plasmaprøvetesting felles for alle inkluderte forsøkspersoner: alle inkluderte forsøkspersoner vil gjennomgå standard plasmatesting, inkludert VWF-antigen, FVIII-aktivitet, VWF-aktivitet (VWF:RCo eller VWF:GPIbR), VWF kollagenbindingsaktivitet og VWF propeptid.
Lavoppløselig VWF multimeranalyse vil bli utført ved bruk av enten den interne metoden eller det semi-automatiserte systemet.
Prosedyrer som skal utføres på ECFC-er (felles for alle inkluderte forsøkspersoner):
- ECFC-isolering vil følge en modifisert versjon av protokollen av Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
- Flytsytometri vil bli utført for å bekrefte endotelial linje.
- Konfokal immunofluorescensmikroskopi vil bli utført ved å plassere ECFC-er på glassplater dekket med rottehale kollagen type I. Valgte markører vil inkludere DAPI for kjerner, VWF og andre endoteliale markører.
- Basal og stimulert VWF-sekresjon (etter histamin- eller PMA-eksponering) vil bli vurdert ved å måle VWF:Ag-nivåer i kulturmedium og cellelysater ved bruk av en intern ELISA.
- VWF multimeranalyse vil bli utført ved bruk av samme prosedyre som anvendt på plasmaprøver.
- RNA-uttrykksanalyse vil inkludere RNA-isolasjon, førstestrangs cDNA-syntese og kvantitativ sanntids-PCR for VWF og ytterligere markører ved bruk av forhåndsdesignede TaqMan®-analyser (ThermoFisher Scientific), normalisert til GAPDH eller andre huskeholdsgener.
Analyse begrenset til ECFC-er isolert fra gruppe B-pasienter og utvalgte kontroller:
Angiogeneseanalyse vil bli utført ved bruk av Matrigel (Corning). ECFC-er fra friske frivillige vil bli brukt til å etablere analysens betingelser og vil tjene som referanse for analysen av ECFC-er isolert fra pasienter.
Analyse begrenset til ECFC-er isolert fra gruppe C og utvalgte kontroller: undergruppestudie:
Inhibisjon av det mutante allelet ved bruk av small interfering RNA (siRNA) vil bli utført på en pasient valgt basert på den spesifikke genetiske defekten (type 2A-mutasjon). ECFC-er fra denne pasienten vil bli transfisert med en tilpasset siRNA rettet mot det mutante allelet, mens en kommersiell VWF-spesifikk siRNA og en negativ kontroll-siRNA vil bli brukt som kontroller på både type 2A-ECFC-er og ECFC-er fra friske frivillige. Alle ECFC-prosedyrer vil bli gjentatt etter siRNA-silencing, og resultater vil bli sammenlignet med de som er oppnådd fra friske kontroll-ECFC-er.
Dataanalyse Kontinuerlige variabler vil bli rapportert som median og interkvartilområde, mens kategoriske variabler vil bli presentert som antall og prosent. Laboratorieresultater vil bli uttrykt som gjennomsnitt og standardavvik. Sammenligninger vil bli utført ved bruk av enveis ANOVA eller Kruskal-Wallis-tester, avhengig av om variabler følger en normal eller ikke-normal fordeling. En p-verdi <0,05 vil bli ansett som statistisk signifikant.
Korrelasjonsanalyser mellom VWF mRNA-uttrykksnivåer og VWF sekret i cellemedium, cellelysater og tilsvarende plasma VWF-nivåer vil bli utført ved bruk av Pearson's eller Spearman's rangkorrelasjon, etter behov.
Når tilgjengelig, vil analyser bli utført ved bruk av mer enn én ECFC-klone fra hver inkluderte forsøksperson.
Studietype
Registrering (Antatt)
Kontakter og plasseringer
Studiekontakt
- Navn: Flora Peyvandi, MD, PhD
- Telefonnummer: +39 02-55035414
- E-post: flora.peyvandi@policlinico.mi.it
Studiesteder
-
-
-
Milan, Italia, 20122
- Rekruttering
- Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, A.B.Bonomi Hemophilia and Thrombosis Center
-
Ta kontakt med:
- Flora Peyvandi, MD, PhD
- Telefonnummer: +39 02-55035414
- E-post: flora.peyvandi@policlinico.mi.it
-
-
Deltakelseskriterier
Kvalifikasjonskriterier
Alder som er kvalifisert for studier
- Barn
- Voksen
- Eldre voksen
Tar imot friske frivillige
Prøvetakingsmetode
Studiepopulasjon
Studien vil inkludere rekruttering av personer med en tidligere diagnose av VWD eller AVWS og en gruppe friske frivillige (kontroller). Pasienter vil bli valgt blant de som er henvist til Angelo Bianchi Bonomi Hemofili- og Trombosesenter, med en tidligere diagnose av VWD eller AVWS.
Friske frivillige, definert som personer uten tidligere diagnose av blødnings- eller tromboseforstyrrelser, vil bli rekruttert i likt antall som tilfellene med mål om å skape en ECFCs-referansegruppe. Ved rekruttering vil kontrollene gjennomgå et intervju for å bekrefte deres helsetilstand, de vil bli bedt om å signere informert samtykke, og deretter vil de gjennomgå en blodprøvetaking nødvendig for å bekrefte plasma VWF-nivåer og isolere ECFCs som allerede beskrevet for pasienter.
Beskrivelse
Inklusjonskriterier for pasienter:
Pasienter med von Willebrands sykdom (VWD) eller ervervet von Willebrand syndrom (AVWS)
Alder ≥ 16 år.
Tidligere diagnose av von Willebrands sykdom eller ervervet von Willebrand syndrom, definert som ett av følgende:
Gruppe A - Type 1 VWD:
VWF-nivåer ≤ 30 IU/dL, uavhengig av blødningshistorikk, eller
VWF-nivåer ≤ 0,50 IU/mL ved tilstedeværelse av unormal blødning.
Gruppe B - Medfødt eller ervervet VWD (VWD eller AVWS):
Diagnose av medfødt eller ervervet VWD, med eller uten gastrointestinal blødning.
Gruppe C - Undergruppestudie (Type 2A VWD):
Én pasient med type 2A VWD valgt ut til en dedikert delstudie som involverer allelspesifisk siRNA-silencing av det mutante allelet.
Evne og vilje til å gi skriftlig informert samtykke.
For pasienter uten tidligere molekylær karakterisering: vilje til å gjennomgå VWF-gensekvensering og å signere det relaterte informerte samtykket.
Inklusjonskriterier for friske frivillige
- Ingen tidligere diagnose av VWD, blødningsforstyrrelser eller trombotiske forstyrrelser.
- Vilje til å donere blod for studieprosedyrer.
- Evne og vilje til å gi skriftlig informert samtykke.
- Alder ≥ 18 år.
Eksklusjonskriterier for både pasienter og friske frivillige:
- Svangerskap.
- Anemi, som fastsatt ved screening eller basert på medisinsk historikk.
Studieplan
Hvordan er studiet utformet?
Designdetaljer
Kohorter og intervensjoner
Gruppe / Kohort |
Intervensjon / Behandling |
|---|---|
|
pasienter med von willebrands sykdom / ervervet von willebrands sykdom
Pasienter med bekreftet diagnose av VWD eller AVWS.
Deltakerne vil gjennomgå perifert blodprøveinnsamling for måling av VWF i plasma og isolering og karakterisering av ECFC-er.
Hos pasienter med VWD uten tidligere molekylær karakterisering, vil det bli samlet inn en ekstra blodprøve for genetisk analyse.
|
Plasma-prøver vil bli samlet inn for måling av VWF-nivåer.
Blodprøver vil bli samlet inn for å isolere ECFC-er og utføre deres påfølgende karakterisering.
Et ekstra blodprøve vil bli tatt for VWF-genetisk testing hos pasienter med VWD uten tidligere molekylær karakterisering.
|
|
Friske donorer
Friske frivillige uten personlig eller familiehistorikk med blødnings- eller tromboselidelser, som fungerer som referansepopulasjon for studien.
Deltakerne vil gjennomgå perifert blodprøveinnsamling for plasma VWF-målinger og ECFCs-isolasjon og karakterisering.
|
Plasma-prøver vil bli samlet inn for måling av VWF-nivåer.
Blodprøver vil bli samlet inn for å isolere ECFC-er og utføre deres påfølgende karakterisering.
|
Hva måler studien?
Primære resultatmål
Resultatmål |
Tiltaksbeskrivelse |
Tidsramme |
|---|---|---|
|
ECFCs isolering og karakterisering
Tidsramme: 42 uker fra påmeldingsstart
|
Vurdering av forskjeller mellom ECFC-er avledet fra pasienter med VWD eller AVWS og friske kontroller. Basal og stimulert VWF-produksjon og -sekresjon av ECFC-er, inkludert basale VWF-nivåer i kulturmedium og cellelysater og stimulert VWF-frigjøring etter eksponering for biologiske eller kjemiske forbindelser, målt med ELISA (IU/dL) og sammenlignet mellom pasienter med VWD/AVWS og friske kontroller. VWF mRNA-uttrykksnivåer i ECFC-er, vurdert med kvantitativ real-time PCR og uttrykt som ΔΔCt, sammenlignet mellom pasienter med VWD/AVWS og friske kontroller. |
42 uker fra påmeldingsstart
|
Sekundære resultatmål
Resultatmål |
Tiltaksbeskrivelse |
Tidsramme |
|---|---|---|
|
Korrelasjon av ECFC VWF-antigenprotein og mRNA-nivåer med plasma- og platelet-VWF-antigen-/aktivitetsnivåer og molekylær defekt.
Tidsramme: 42 uker fra påmeldingsstart
|
Korrelasjonsanalyser mellom ECFC-avledede VWF-parametere og sirkulerende VWF-nivåer hos tilsvarende pasienter med VWD, AVWS og friske kontroller.
ECFC-avledede VWF-antigennivåer i kulturmedium og cellelysater (IU/dL), målt med ELISA, og VWF mRNA-uttrykksnivåer i ECFC-er (ΔΔCt), vurdert med kvantitativ real-time PCR, vil bli korrelert med plasma- og platelet VWF-antigen og aktivitetsnivåer (IU/dL).
Alle ECFC-avledede og sirkulerende VWF-parametere vil i tillegg bli analysert i forhold til den spesifikke underliggende molekylære defekten.
|
42 uker fra påmeldingsstart
|
|
Sammenligning av angiogene egenskaper ved ECFC fra pasienter med VWD/AVWS og friske kontroller
Tidsramme: 42 uker fra påmeldingsstart
|
Angiogene egenskaper til ECFCs vil bli vurdert ved bruk av en in vitro Matrigel-rørformasjonsassay og sammenlignet mellom pasienter med type 2 eller type 3 VWD eller AVWS og friske kontroller.
Kvantitative parametere vil inkludere total rørlengde (µm), antall rør, antall grener og antall masker. |
42 uker fra påmeldingsstart
|
|
Evaluering av allelspesifikk siRNA for å gjenopprette normale VWF-nivåer i type 2A VWD
Tidsramme: 42 uker fra påmeldingens start
|
Allele-spesifikk small interfering RNA (siRNA) vil bli evaluert i endoteliale ECFC-er avledet fra en pasient med type 2A VWD for å vurdere om selektiv hemming av den mutante allelen gjenoppretter normal VWF-uttrykk og sekresjon.
Alle analyser vil bli utført før og etter siRNA-transfeksjon.
Følgende parametere vil bli vurdert: VWF mRNA-uttrykksnivåer, vurdert ved kvantitativ real-time PCR og uttrykt som ΔΔCt (relativt uttrykk); VWF-proteinnivåer i ECFC-kulturmedium, målt ved ELISA (IU/mL).
|
42 uker fra påmeldingens start
|
Samarbeidspartnere og etterforskere
Studierekorddatoer
Studer hoveddatoer
Studiestart (Faktiske)
Primær fullføring (Antatt)
Studiet fullført (Antatt)
Datoer for studieregistrering
Først innsendt
Først innsendt som oppfylte QC-kriteriene
Først lagt ut (Faktiske)
Oppdateringer av studieposter
Sist oppdatering lagt ut (Faktiske)
Siste oppdatering sendt inn som oppfylte QC-kriteriene
Sist bekreftet
Mer informasjon
Begreper knyttet til denne studien
Nøkkelord
Ytterligere relevante MeSH-vilkår
- Genetiske sykdommer, medfødte
- Hematologiske sykdommer
- Blodkoagulasjonsforstyrrelser
- Hemoragiske lidelser
- Blodplateforstyrrelser
- Blodkoagulasjonsforstyrrelser, arvelig
- Koagulasjonsproteinforstyrrelser
- Medfødte, arvelige og neonatale sykdommer og abnormiteter
- Hemic og lymfatiske sykdommer
- von Willebrand sykdommer
Andre studie-ID-numre
- 3387 n.6569
Plan for individuelle deltakerdata (IPD)
Planlegger du å dele individuelle deltakerdata (IPD)?
Legemiddel- og utstyrsinformasjon, studiedokumenter
Studerer et amerikansk FDA-regulert medikamentprodukt
Studerer et amerikansk FDA-regulert enhetsprodukt
Denne informasjonen ble hentet direkte fra nettstedet clinicaltrials.gov uten noen endringer. Hvis du har noen forespørsler om å endre, fjerne eller oppdatere studiedetaljene dine, vennligst kontakt register@clinicaltrials.gov. Så snart en endring er implementert på clinicaltrials.gov, vil denne også bli oppdatert automatisk på nettstedet vårt. .