Komórki śródbłonka tworzące kolonie u pacjentów z VWD, AVWS i u osób zdrowych (ECFCs/2022)

Badanie ma na celu utworzenie populacji referencyjnej komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) od zdrowych osób i porównanie ich z ECFC pochodzącymi od pacjentów z VWD/AVWS.

To porównanie pomoże zidentyfikować zmiany komórkowe i molekularne leżące u podstaw jakościowych i ilościowych defektów VWF. Wyniki zostaną skorelowane z danymi klinicznymi i biochemicznymi w celu wyjaśnienia mechanizmów choroby.

Projekt badania: Jest to krajowe, jednocentrowe, niefarmakologiczne badanie promowane przez Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico i koordynowane przez SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Rekrutacja: Pacjenci z wcześniejszym rozpoznaniem VWD lub AVWS skierowani do Centrum Hemofilii i Zakrzepicy Angelo Bianchi Bonomi zostaną skontaktowani w celu zaplanowanej rekrutacji. Historyczne dane kliniczne, biochemiczne i molekularne zostaną przejrzane, uzyskano świadomą zgodę, a próbka krwi specyficzna dla badania zostanie pobrana w celu potwierdzenia poziomów VWF i izolacji ECFC.

Zdrowi ochotnicy bez historii zaburzeń krwawienia lub zakrzepicy zostaną zrekrutowani w liczbie równej grupie pacjentów. Po krótkiej rozmowie zdrowotnej i świadomej zgodzie przejdą te same procedury pobierania krwi co pacjenci.

Pobieranie próbek:

Uczestnicy przejdą pobranie krwi do następujących procedur:

• Osiem mililitrów osocza w cytrynianie sodu zostanie rozdzielone na porcje i przechowywane w temperaturze -80°C. Próbki te zostaną wykorzystane do potwierdzenia diagnoz pacjentów oraz, w przypadku kontroli, do pomiaru poziomów VWF.
• Analiza genetyczna: jedna probówka z cytrynianem zostanie pobrana od pacjentów z wrodzoną chorobą bez wcześniejszej charakterystyki molekularnej.
• Łącznie 50 ml krwi w heparynie litowej zostanie pobrane do izolacji ECFC zgodnie z opublikowanym wcześniej protokołem. Procedura izolacji zostanie przeprowadzona w ciągu 3 godzin od pobrania próbki. W przypadku nieudanej izolacji uczestnicy mogą zostać poproszeni o drugie i ostateczne pobranie krwi.

Badanie próbek osocza wspólne dla wszystkich zrekrutowanych osób: wszyscy zrekrutowani uczestnicy przejdą standardowe badanie osocza, w tym antygen VWF, aktywność FVIII, aktywność VWF (VWF:RCo lub VWF:GPIbR), aktywność wiązania kolagenu VWF oraz propeptyd VWF.

Analiza multimerów VWF o niskiej rozdzielczości zostanie przeprowadzona przy użyciu metody wewnętrznej lub systemu półautomatycznego.

Procedura do wykonania na ECFC (wspólna dla wszystkich zrekrutowanych osób):

• Izolacja ECFC będzie zgodna ze zmodyfikowaną wersją protokołu Martina-Ramireza i in. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Przeprowadzona zostanie cytometria przepływowa w celu potwierdzenia pochodzenia śródbłonkowego.
• Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna zostanie przeprowadzona poprzez wysianie ECFC na szkiełkach pokrytych kolagenem typu I z ogona szczura. Wybrane markery będą obejmować DAPI dla jąder, VWF i inne markery śródbłonkowe.
• Podstawowe i stymulowane wydzielanie VWF (po ekspozycji na histaminę lub PMA) zostanie ocenione poprzez pomiar poziomów VWF:Ag w podłożu hodowlanym i lizatach komórkowych przy użyciu wewnętrznego testu ELISA.
• Analiza multimerów VWF zostanie przeprowadzona przy użyciu tej samej procedury zastosowanej dla próbek osocza.
• Analiza ekspresji RNA będzie obejmować izolację RNA, syntezę cDNA pierwszej nici i ilościową PCR w czasie rzeczywistym dla VWF i dodatkowych markerów przy użyciu wstępnie zaprojektowanych testów TaqMan® (ThermoFisher Scientific), znormalizowanych do GAPDH lub innych genów gospodarstwa domowego.

Test ograniczony do ECFC wyizolowanych od pacjentów z grupy B i wybranych kontroli:

Test angiogenezy zostanie przeprowadzony przy użyciu Matrigel (Corning). ECFC uzyskane od zdrowych ochotników zostaną wykorzystane do ustalenia warunków testu i posłużą jako odniesienie do analizy ECFC wyizolowanych od pacjentów.

Test ograniczony do ECFC wyizolowanych z grupy C i wybranych kontroli: badanie podgrupy:

Hamowanie allelu mutantowego przy użyciu małego interferującego RNA (siRNA) zostanie przeprowadzone u pacjenta wybranego na podstawie specyficznego defektu genetycznego (mutacja typu 2A). ECFC od tego pacjenta zostaną transfekowane spersonalizowanym siRNA celującym w allel mutantowy, podczas gdy komercyjne siRNA specyficzne dla VWF i negatywne kontrolne siRNA zostaną użyte jako kontrole zarówno na ECFC typu 2A, jak i ECFC pochodzących od zdrowych ochotników. Wszystkie procedury ECFC zostaną powtórzone po wyciszeniu siRNA, a wyniki zostaną porównane z wynikami uzyskanymi od ECFC zdrowych kontroli.

Analiza danych: Zmienne ciągłe będą przedstawiane jako mediana i zakres międzykwartylowy, podczas gdy zmienne kategoryczne będą przedstawiane jako liczby i procenty. Wyniki laboratoryjne będą wyrażane jako średnia i odchylenie standardowe. Porównania zostaną przeprowadzone przy użyciu testów ANOVA jednoczynnikowej lub Kruskala-Wallisa, w zależności od tego, czy zmienne mają rozkład normalny czy nienormalny. Wartość p <0,05 będzie uważana za statystycznie istotną.

Analizy korelacji między poziomami ekspresji mRNA VWF a VWF wydzielonym w podłożu komórkowym, lizatach komórkowych i odpowiadającymi poziomami VWF w osoczu zostaną przeprowadzone przy użyciu korelacji Pearsona lub rang Spearmana, w zależności od potrzeb.

Jeśli będą dostępne, analizy zostaną przeprowadzone przy użyciu więcej niż jednego klonu ECFC od każdego zrekrutowanego uczestnika.