Эндотелиальные колониеобразующие клетки у пациентов с ВВБ, АВВС и здоровых субъектов (ECFCs/2022)

Исследование направлено на создание референтной популяции эндотелиальных колониеобразующих клеток (ЭКОК) от здоровых субъектов и их сравнение с ЭКОК, полученными от пациентов с ВВБ/ПВВБ.

Это сравнение поможет выявить клеточные и молекулярные изменения, лежащие в основе качественных и количественных дефектов ФВ. Результаты будут коррелировать с клиническими и биохимическими данными для уточнения механизмов заболевания.

Дизайн исследования: Это национальное, моноцентрическое, нефармакологическое исследование, инициированное Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico и координируемое SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Набор: Пациенты с ранее установленным диагнозом ВВБ или ПВВБ, направленные в Центр гемофилии и тромбоза Анджело Бьянки Бономи, будут приглашены для планового включения. Будут изучены исторические клинические, биохимические и молекулярные данные, получено информированное согласие и собран специфический для исследования образец крови для подтверждения уровня ФВ и выделения ЭКОК.

Здоровые добровольцы без анамнеза кровоточивости или тромботических нарушений будут включены в количестве, равном группе пациентов. После краткого опроса о состоянии здоровья и получения информированного согласия они пройдут те же процедуры забора крови, что и пациенты.

Сбор образцов:

Участники пройдут забор крови для следующих процедур:

• Восемь миллилитров плазмы в цитрате натрия будут аликвотированы и храниться при -80 °C. Эти образцы будут использованы для подтверждения диагноза пациентов и, для контроля, для измерения уровня ФВ.
• Генетический анализ: одна пробирка с цитратом будет собрана для пациентов с врожденной формой без предыдущей молекулярной характеристики.
• Всего 50 мл крови в литиевом гепарине будет взято для выделения ЭКОК в соответствии с ранее опубликованным протоколом. Процедура выделения будет выполнена в течение 3 часов после сбора образца. В случае неудачного выделения участники могут быть приглашены на второй и последний забор крови.

Тестирование образцов плазмы, общее для всех включенных субъектов: все включенные субъекты пройдут стандартное тестирование плазмы, включая антиген ФВ, активность ФVIII, активность ФВ (ФВ:RCo или ФВ:GPIbR), коллаген-связывающую активность ФВ и пропептид ФВ.

Анализ мультимеров ФВ низкого разрешения будет выполнен с использованием либо внутреннего метода, либо полуавтоматической системы.

Процедуры, выполняемые на ЭКОК (общие для всех включенных субъектов):

• Выделение ЭКОК будет следовать модифицированной версии протокола Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Будет выполнена проточная цитометрия для подтверждения эндотелиальной линии.
• Будет выполнена конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия путем нанесения ЭКОК на предметные стекла, покрытые коллагеном типа I из хвоста крысы. Выбранные маркеры будут включать DAPI для ядер, ФВ и другие эндотелиальные маркеры.
• Базальная и стимулированная секреция ФВ (после воздействия гистамина или ФМА) будет оценена путем измерения уровня ФВ:Ag в культуральной среде и клеточных лизатах с использованием внутреннего ИФА.
• Анализ мультимеров ФВ будет выполнен с использованием той же процедуры, что и для образцов плазмы.
• Анализ экспрессии РНК будет включать выделение РНК, синтез кДНК первой цепи и количественную ПЦР в реальном времени для ФВ и дополнительных маркеров с использованием предварительно разработанных TaqMan® анализов (ThermoFisher Scientific), нормализованных к GAPDH или другим референсным генам.

Анализ, ограниченный ЭКОК, выделенными от пациентов группы B и отобранных контролей:

Ангиогенезный анализ будет выполнен с использованием Matrigel (Corning). ЭКОК, полученные от здоровых добровольцев, будут использованы для установки условий анализа и послужат референсом для анализа ЭКОК, выделенных от пациентов.

Анализ, ограниченный ЭКОК, выделенными от пациентов группы C и отобранных контролей: подгрупповое исследование:

Ингибирование мутантного аллеля с использованием малой интерферирующей РНК (миРНК) будет выполнено у пациента, отобранного на основе специфического генетического дефекта (мутация типа 2A). ЭКОК от этого пациента будут трансфицированы индивидуальной миРНК, нацеленной на мутантный аллель, в то время как коммерческая специфичная к ФВ миРНК и отрицательная контрольная миРНК будут использованы в качестве контролей как на ЭКОК типа 2A, так и на ЭКОК, полученных от здоровых добровольцев. Все процедуры с ЭКОК будут повторены после сайленсинга миРНК, и результаты будут сравнены с полученными от ЭКОК здоровых контролей.

Анализ данных: Непрерывные переменные будут представлены как медиана и межквартильный размах, тогда как категориальные переменные будут представлены как количество и проценты. Лабораторные результаты будут выражены как среднее и стандартное отклонение. Сравнения будут выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA или критерия Краскела-Уоллиса, в зависимости от того, следуют ли переменные нормальному или ненормальному распределению. Значение p <0,05 будет считаться статистически значимым.

Корреляционный анализ между уровнями экспрессии мРНК ФВ и ФВ, секретированного в клеточную среду, клеточных лизатах и соответствующих уровней ФВ в плазме, будет проведен с использованием корреляции Пирсона или ранговой корреляции Спирмена, в зависимости от ситуации.

При наличии, анализы будут выполнены с использованием более чем одного клона ЭКОК от каждого включенного субъекта.