Células Progenitoras Endoteliais Formadoras de Colónias em Doentes com DvW, SAvW e Indivíduos Saudáveis (ECFCs/2022)
Isolamento e Caracterização de Células Formadoras de Colónias Endoteliais (ECFCs) em Doentes Diagnosticados com Doença de Von Willebrand, Síndrome de Von Willebrand Adquirida e Indivíduos Saudáveis
Visão geral do estudo
Status
Descrição detalhada
O estudo visa estabelecer uma população de referência de células formadoras de colónias endoteliais (ECFCs) de indivíduos saudáveis e compará-las com ECFCs derivadas de doentes com VWD/AVWS.
Esta comparação ajudará a identificar alterações celulares e moleculares subjacentes a defeitos qualitativos e quantitativos do VWF. Os resultados serão correlacionados com dados clínicos e bioquímicos para esclarecer os mecanismos da doença.
Desenho do estudo: Este é um estudo nacional, monocêntrico, não farmacológico, promovido pela Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico e coordenado pela SC Medicina - Emostasi e Trombosi.
Recrutamento: Serão contactados para inscrição programada doentes com diagnóstico prévio de VWD ou AVWS referenciados ao Centro de Hemofilia e Trombose Angelo Bianchi Bonomi. Serão revistos dados clínicos, bioquímicos e moleculares históricos, obtido consentimento informado e recolhida uma amostra de sangue específica do estudo para confirmar os níveis de VWF e isolar ECFCs.
Voluntários saudáveis sem historial de distúrbios hemorrágicos ou trombóticos serão recrutados em número igual ao do grupo de doentes. Após uma breve entrevista de saúde e consentimento informado, serão submetidos aos mesmos procedimentos de colheita de sangue que os doentes.
Colheita de amostras:
Os participantes serão submetidos a colheita de sangue para os seguintes procedimentos:
- Oito mililitros de plasma em citrato de sódio serão alíquotados e armazenados a -80 °C. Estas amostras serão utilizadas para confirmar os diagnósticos dos doentes e, para os controlos, para medir os níveis de VWF.
- Análise genética: será recolhido um tubo de citrato para doentes congénitos sem caracterização molecular prévia.
- Serão colhidos um total de 50 ml de sangue em heparina de lítio para isolamento de ECFCs de acordo com o protocolo previamente publicado. O procedimento de isolamento será realizado dentro de 3 h após a colheita da amostra. Em caso de isolamento sem sucesso, poderá ser solicitado aos participantes que realizem uma segunda e última colheita de sangue.
Teste de amostras de plasma comum a todos os sujeitos recrutados: todos os sujeitos recrutados serão submetidos a testes plasmáticos padrão, incluindo antigénio VWF, atividade FVIII, atividade VWF (VWF:RCo ou VWF:GPIbR), atividade de ligação ao colagénio VWF e pró-peptídeo VWF.
A análise de multímeros VWF de baixa resolução será realizada utilizando o método interno ou o sistema semi-automatizado.
Procedimento a ser realizado nas ECFCs (comum a todos os sujeitos recrutados):
- O isolamento de ECFCs seguirá uma versão modificada do protocolo de Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
- Será realizada citometria de fluxo para confirmar a linhagem endotelial.
- Será realizada microscopia de imunofluorescência confocal colocando ECFCs em lâminas de vidro revestidas com colagénio tipo I de cauda de rato. Os marcadores selecionados incluirão DAPI para núcleos, VWF e outros marcadores endoteliais.
- A secreção basal e estimulada de VWF (após exposição a histamina ou PMA) será avaliada medindo os níveis de VWF:Ag em meios de cultura e lisados celulares utilizando um ELISA interno.
- A análise multimérica de VWF será realizada utilizando o mesmo procedimento aplicado às amostras de plasma.
- A análise de expressão de RNA incluirá isolamento de RNA, síntese de cDNA de primeira cadeia e PCR quantitativo em tempo real para VWF e marcadores adicionais utilizando ensaios TaqMan® pré-desenhados (ThermoFisher Scientific), normalizados para GAPDH ou outros genes de referência.
Ensaio limitado a ECFCs isoladas de doentes do grupo B e controlos selecionados:
Será realizado um ensaio de angiogénese utilizando Matrigel (Corning). ECFCs obtidas de voluntários saudáveis serão utilizadas para estabelecer as condições do ensaio e servirão como referência para a análise de ECFCs isoladas de doentes.
Ensaio limitado a ECFCs isoladas do grupo C e controlos selecionados: subestudo:
A inibição do alelo mutante utilizando pequeno RNA interferente (siRNA) será realizada num doente selecionado com base no defeito genético específico (mutação tipo 2A). As ECFCs deste doente serão transfectadas com um siRNA personalizado direcionado ao alelo mutante, enquanto um siRNA comercial específico para VWF e um siRNA de controlo negativo serão utilizados como controlos tanto em ECFCs tipo 2A como em ECFCs derivadas de voluntários saudáveis. Todos os procedimentos com ECFCs serão repetidos após silenciamento por siRNA, e os resultados serão comparados com os obtidos a partir de ECFCs de controlo saudáveis.
Análise de dados: As variáveis contínuas serão reportadas como mediana e intervalo interquartil, enquanto as variáveis categóricas serão apresentadas como contagens e percentagens. Os resultados laboratoriais serão expressos como média e desvio padrão. As comparações serão realizadas utilizando testes ANOVA de uma via ou Kruskal-Wallis, dependendo se as variáveis seguem uma distribuição normal ou não normal. Um valor de p <0,05 será considerado estatisticamente significativo.
As análises de correlação entre os níveis de expressão de mRNA de VWF e VWF secretado em meios celulares, lisados celulares e níveis plasmáticos de VWF correspondentes serão conduzidas utilizando a correlação de Pearson ou a correlação de postos de Spearman, conforme apropriado.
Quando disponível, as análises serão realizadas utilizando mais do que um clone de ECFC de cada sujeito recrutado.
Tipo de estudo
Inscrição (Estimado)
Contactos e Locais
Contato de estudo
- Nome: Flora Peyvandi, MD, PhD
- Número de telefone: +39 02-55035414
- E-mail: flora.peyvandi@policlinico.mi.it
Locais de estudo
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Milan, Itália, 20122
- Recrutamento
- Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, A.B.Bonomi Hemophilia and Thrombosis Center
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Contato:
- Flora Peyvandi, MD, PhD
- Número de telefone: +39 02-55035414
- E-mail: flora.peyvandi@policlinico.mi.it
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Critérios de participação
Critérios de elegibilidade
Idades elegíveis para estudo
- Filho
- Adulto
- Adulto mais velho
Aceita Voluntários Saudáveis
Método de amostragem
População do estudo
O estudo incluirá o recrutamento de indivíduos com um diagnóstico prévio de VWD ou AVWS e um grupo de voluntários saudáveis (controlos). Os doentes serão selecionados entre os referenciados no Centro de Hemofilia e Trombose Angelo Bianchi Bonomi, com um diagnóstico prévio de VWD ou AVWS.
Voluntários saudáveis, definidos como indivíduos sem diagnóstico prévio de distúrbios hemorrágicos ou trombóticos, serão recrutados em número igual aos casos, com o objetivo de criar um grupo de referência de ECFCs. No recrutamento, os controlos serão submetidos a uma entrevista para confirmar o seu estado de saúde, será-lhes pedido que assinem o consentimento informado e, em seguida, serão submetidos a uma colheita de sangue necessária para confirmar os níveis plasmáticos de VWF e para isolar ECFCs, tal como já descrito para os doentes.
Descrição
Critérios de Inclusão para pacientes:
Pacientes com doença de von Willebrand (VWD) ou síndrome de von Willebrand adquirida (AVWS)
Idade ≥ 16 anos.
Diagnóstico prévio de doença de von Willebrand ou síndrome de von Willebrand adquirida, definido como um dos seguintes:
Grupo A - VWD Tipo 1:
Níveis de VWF ≤ 30 UI/dL, independentemente do histórico de hemorragia, ou
Níveis de VWF ≤ 0,50 UI/mL na presença de hemorragia anormal.
Grupo B - VWD congénita ou adquirida (VWD ou AVWS):
Diagnóstico de VWD congénita ou adquirida, com ou sem hemorragia gastrointestinal.
Grupo C - Subestudo (VWD Tipo 2A):
Um paciente com VWD tipo 2A selecionado para um subestudo dedicado envolvendo silenciamento de siRNA específico do alelo mutante.
Capacidade e vontade de fornecer consentimento informado por escrito.
Para pacientes sem caracterização molecular prévia: vontade de realizar sequenciação do gene VWF e de assinar o consentimento informado relacionado.
Critérios de inclusão para voluntários saudáveis
- Sem diagnóstico prévio de VWD, distúrbios hemorrágicos ou distúrbios trombóticos.
- Vontade de doar sangue para procedimentos do estudo.
- Capacidade e vontade de fornecer consentimento informado por escrito.
- Idade ≥ 18 anos.
Critérios de exclusão para pacientes e voluntários saudáveis:
- Gravidez.
- Anemia, conforme determinado no rastreio ou com base no histórico médico.
Plano de estudo
Como o estudo é projetado?
Detalhes do projeto
Coortes e Intervenções
Grupo / Coorte |
Intervenção / Tratamento |
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doentes com doença de von Willebrand / doença de von Willebrand adquirida
Pacientes com diagnóstico confirmado de VWD ou AVWS.
Os participantes serão submetidos à colheita de amostras de sangue periférico para medições de VWF plasmático e isolamento e caracterização de ECFCs.
Em pacientes com VWD sem caracterização molecular prévia, será recolhida uma amostra de sangue adicional para análise genética.
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As amostras de plasma serão recolhidas para medição dos níveis de VWF.
Serão recolhidas amostras de sangue para isolar ECFCs e efetuar a sua caracterização subsequente.
Será recolhida uma amostra de sangue adicional para testes genéticos de VWF em doentes com VWD sem caracterização molecular prévia.
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Doadores saudáveis
Voluntários saudáveis sem antecedentes pessoais ou familiares de distúrbios hemorrágicos ou trombóticos, servindo como população de referência para o estudo.
Os participantes serão submetidos à recolha de amostras de sangue periférico, medições de VWF no plasma e isolamento e caracterização de ECFCs.
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As amostras de plasma serão recolhidas para medição dos níveis de VWF.
Serão recolhidas amostras de sangue para isolar ECFCs e efetuar a sua caracterização subsequente.
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O que o estudo está medindo?
Medidas de resultados primários
Medida de resultado |
Descrição da medida |
Prazo |
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Isolamento e caracterização de ECFCs
Prazo: 42 semanas desde o início do recrutamento
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Avaliação das diferenças entre ECFCs derivados de pacientes com VWD ou AVWS e controlos saudáveis. Produção e secreção basal e estimulada de VWF pelos ECFCs, incluindo os níveis basais de VWF em meios de cultura e lisados celulares e a libertação estimulada de VWF após exposição a compostos biológicos ou químicos, medidos por ELISA (IU/dL) e comparados entre pacientes com VWD/AVWS e controlos saudáveis. Níveis de expressão de mRNA de VWF em ECFCs, avaliados por PCR quantitativo em tempo real e expressos como ΔΔCt, comparados entre pacientes com VWD/AVWS e controlos saudáveis. |
42 semanas desde o início do recrutamento
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Medidas de resultados secundários
Medida de resultado |
Descrição da medida |
Prazo |
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Correlação dos Níveis de Antigénio de VWF e mRNA das Células Progenitoras Endoteliais (ECFC) com os Níveis de Antigénio/Atividade de VWF no Plasma e Plaquetas e Defeito Molecular.
Prazo: 42 semanas a partir do início da inscrição
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Análises de correlação entre parâmetros de VWF derivados de ECFC e níveis circulantes de VWF em doentes correspondentes com VWD, AVWS e controlos saudáveis.
Os níveis de antigénio de VWF derivados de ECFC em meios de cultura e lisados celulares (IU/dL), medidos por ELISA, e os níveis de expressão de mRNA de VWF em ECFCs (ΔΔCt), avaliados por PCR quantitativo em tempo real, serão correlacionados com os níveis de antigénio e atividade de VWF no plasma e nas plaquetas (IU/dL).
Todos os parâmetros de VWF derivados de ECFC e circulantes serão adicionalmente analisados em relação ao defeito molecular subjacente específico.
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42 semanas a partir do início da inscrição
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Comparação das propriedades angiogénicas das ECFCs de pacientes com VWD/AVWS e controlos saudáveis
Prazo: 42 semanas desde o início do recrutamento
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As propriedades angiogénicas dos ECFC serão avaliadas através de um ensaio de formação de tubos in vitro com Matrigel e comparadas entre doentes com doença de von Willebrand tipo 2 ou tipo 3 ou síndrome de von Willebrand adquirida e controlos saudáveis.
Os parâmetros quantitativos incluirão o comprimento total dos tubos (µm), o número de tubos, o número de ramificações e o número de malhas.
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42 semanas desde o início do recrutamento
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Avaliação do siRNA Alelo-Específico para Restaurar os Níveis Normais de VWF na Doença de von Willebrand Tipo 2A
Prazo: 42 semanas a partir do início do recrutamento
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O siRNA (small interfering RNA) alelo-específico será avaliado em ECFCs endoteliais derivadas de um paciente com VWD tipo 2A para avaliar se a inibição seletiva do alelo mutante restaura a expressão e secreção normais de VWF.
Todas as análises serão realizadas antes e após a transfecção com siRNA.
Os seguintes parâmetros serão avaliados: níveis de expressão de mRNA de VWF, avaliados por PCR quantitativo em tempo real e expressos como ΔΔCt (expressão relativa); níveis de proteína VWF nos meios de cultura de ECFC, medidos por ELISA (IU/mL).
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42 semanas a partir do início do recrutamento
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Colaboradores e Investigadores
Datas de registro do estudo
Datas Principais do Estudo
Início do estudo (Real)
Conclusão Primária (Estimado)
Conclusão do estudo (Estimado)
Datas de inscrição no estudo
Enviado pela primeira vez
Enviado pela primeira vez que atendeu aos critérios de CQ
Primeira postagem (Real)
Atualizações de registro de estudo
Última Atualização Postada (Real)
Última atualização enviada que atendeu aos critérios de controle de qualidade
Última verificação
Mais Informações
Termos relacionados a este estudo
Palavras-chave
Termos MeSH relevantes adicionais
- Doenças Genéticas, Congênitas
- Doenças Hematológicas
- Distúrbios da Coagulação Sanguínea
- Distúrbios hemorrágicos
- Distúrbios das plaquetas sanguíneas
- Distúrbios da Coagulação Sanguínea, Herdados
- Distúrbios da Proteína de Coagulação
- Doenças e Anormalidades Congênitas, Hereditárias e Neonatais
- Doenças hemic e linfáticas
- Von Willebrand doenças
Outros números de identificação do estudo
- 3387 n.6569
Plano para dados de participantes individuais (IPD)
Planeja compartilhar dados de participantes individuais (IPD)?
Informações sobre medicamentos e dispositivos, documentos de estudo
Estuda um medicamento regulamentado pela FDA dos EUA
Estuda um produto de dispositivo regulamentado pela FDA dos EUA
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