血管性血友病、获得性血管性血友病综合征患者与健康受试者的内皮集落形成细胞 (ECFCs/2022)

本研究旨在建立来自健康受试者的内皮集落形成细胞（ECFCs）参考群体，并将其与来自VWD/AVWS患者的ECFCs进行比较。

这一比较将有助于识别与VWF质性和定量缺陷相关的细胞和分子改变。研究结果将与临床和生化数据相关联，以阐明疾病机制。

研究设计：这是一项全国性、单中心、非药物性研究，由Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico发起，由SC Medicina - Emostasi e Trombosi协调。

入组：将联系先前诊断为VWD或AVWS并转诊至Angelo Bianchi Bonomi血友病和血栓形成中心的患者进行计划入组。将回顾历史临床、生化和分子数据，获取知情同意，并收集研究专用血样以确认VWF水平并分离ECFCs。

健康志愿者，无出血或血栓性疾病史，将以与患者组相同的人数入组。经过简短的健康访谈和知情同意后，他们将接受与患者相同的血液采集程序。

样本采集：

参与者将进行采血，用于以下程序：

• 将8毫升柠檬酸钠血浆分装并储存在-80°C。这些样本将用于确认患者的诊断，对于对照组，则用于测量VWF水平。
• 遗传分析：对于先前未进行分子特征分析的先天性患者，将收集一管柠檬酸盐血液。
• 总共将抽取50毫升肝素锂抗凝血，用于按照先前发表的方案分离ECFCs。分离程序将在样本采集后3小时内进行。如果分离不成功，可能会要求参与者进行第二次也是最后一次采血。

所有入组受试者共有的血浆样本检测：所有入组受试者都将接受标准血浆检测，包括VWF抗原、FVIII活性、VWF活性（VWF:RCo或VWF:GPIbR）、VWF胶原结合活性和VWF前肽。

将使用内部方法或半自动化系统进行低分辨率VWF多聚体分析。

将在所有入组受试者的ECFCs上执行的程序：

• ECFC分离将遵循Martin-Ramirez等人方案的修改版本（Nat Protoc. 2012;7:1709-1715）。
• 将进行流式细胞术以确认内皮谱系。
• 将通过将ECFCs铺在涂有大鼠尾I型胶原的玻璃载玻片上进行共聚焦免疫荧光显微镜检查。选定的标记物将包括用于细胞核的DAPI、VWF和其他内皮标记物。
• 将通过使用内部ELISA测量培养基和细胞裂解物中的VWF:Ag水平来评估基础和刺激后（组胺或PMA暴露后）的VWF分泌。
• 将使用与血浆样本相同的程序进行VWF多聚体分析。
• RNA表达分析将包括RNA分离、第一链cDNA合成，以及使用预设计的TaqMan®检测（ThermoFisher Scientific）对VWF和其他标记物进行定量实时PCR，以GAPDH或其他看家基因进行归一化。

仅限于从B组患者和选定对照分离的ECFCs的检测：

将使用Matrigel（Corning）进行血管生成检测。从健康志愿者获得的ECFCs将用于建立检测条件，并作为分析从患者分离的ECFCs的参考。

仅限于从C组和选定对照分离的ECFCs的检测：亚组研究：

将在基于特定遗传缺陷（2A型突变）选择的患者中进行使用小干扰RNA（siRNA）抑制突变等位基因的实验。来自该患者的ECFCs将用针对突变等位基因的定制siRNA转染，而商业VWF特异性siRNA和阴性对照siRNA将用作对照，用于2A型ECFCs和健康志愿者来源的ECFCs。在siRNA沉默后，将重复所有ECFC程序，并将结果与从健康对照ECFCs获得的结果进行比较。

数据分析 连续变量将以中位数和四分位距报告，而分类变量将以计数和百分比呈现。实验室结果将以均值和标准差表示。将使用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验进行比较，具体取决于变量是否服从正态或非正态分布。p值<0.05将被认为具有统计学意义。

将使用Pearson或Spearman秩相关（视情况而定）进行VWF mRNA表达水平与细胞培养基中分泌的VWF、细胞裂解物中的VWF以及相应血浆VWF水平之间的相关性分析。

在可用的情况下，将使用来自每位入组受试者的多个ECFC克隆进行分析。