Endoteliala kolonibildande celler hos patienter med VWD, AVWS och friska försökspersoner (ECFCs/2022)

Studien syftar till att etablera en referenspopulation av endoteliala koloniformande celler (ECFC) från friska individer och jämföra dem med ECFC som härrör från patienter med VWD/AVWS.

Denna jämförelse kommer att bidra till att identifiera cellulära och molekylära förändringar som ligger till grund för kvalitativa och kvantitativa VWF-defekter. Resultaten kommer att korreleras med kliniska och biokemiska data för att klargöra sjukdomsmekanismer.

Studiedesign: Detta är en nationell, monocentrisk, icke-farmakologisk studie som drivs av Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico och koordineras av SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Rekrytering: Patienter med tidigare diagnos av VWD eller AVWS som remitterats till Angelo Bianchi Bonomi hemofili- och tromboscentrum kommer att kontaktas för planerad rekrytering. Historiska kliniska, biokemiska och molekylära data kommer att granskas, informerat samtycke kommer att inhämtas och ett studiespecifikt blodprov kommer att tas för att bekräfta VWF-nivåer och isolera ECFC.

Friska volontärer utan tidigare blödnings- eller trombossjukdom kommer att rekryteras i ett antal som motsvarar patientgruppen. Efter en kort hälsosamtal och informerat samtycke kommer de att genomgå samma blodinsamlingsprocedurer som patienterna.

Provinsamling:

Deltagarna kommer att genomgå blodprovtagning för följande procedurer:

• Åtta milliliter plasma i natriumcitrat kommer att aliquotas och förvaras vid -80 °C. Dessa prover kommer att användas för att bekräfta patienternas diagnoser och, för kontroller, för att mäta VWF-nivåer.
• Genetisk analys: ett citratrör kommer att samlas in för medfödda patienter utan tidigare molekylär karakterisering.
• Totalt 50 ml blod i litiumheparin kommer att tas för ECFC-isolering enligt den tidigare publicerade protokollet. Isoleringsproceduren kommer att utföras inom 3 timmar efter provtagning. Vid misslyckad isolering kan deltagarna ombedjas att genomgå en andra och sista blodprovtagning.

Plasmaprovtestning gemensam för alla rekryterade individer: alla rekryterade individer kommer att genomgå standard plasmatestning, inklusive VWF-antigen, FVIII-aktivitet, VWF-aktivitet (VWF:RCo eller VWF:GPIbR), VWF-kollagenbindningsaktivitet och VWF-propeptid.

Lågupplöst VWF-multimeranalys kommer att utföras med antingen den interna metoden eller det semiautomatiserade systemet.

Procedur som ska utföras på ECFC (gemensam för alla rekryterade individer):

• ECFC-isolering kommer att följa en modifierad version av protokollet av Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Flödescytometri kommer att utföras för att bekräfta endotelial härkomst.
• Konfokal immunofluorescensmikroskopi kommer att utföras genom att odla ECFC på råttsvans-kollagen typ I-belagda glasplattor. Valda markörer kommer att inkludera DAPI för cellkärnor, VWF och andra endoteliala markörer.
• Basal och stimulerad VWF-utsöndring (efter histamin- eller PMA-exponering) kommer att bedömas genom att mäta VWF:Ag-nivåer i odlingsmedia och celllysat med en intern ELISA.
• VWF-multimeranalys kommer att utföras med samma procedur som tillämpas på plasmaprov.
• RNA-uttrycksanalys kommer att inkludera RNA-isolering, första-sträng cDNA-syntes och kvantitativ realtids-PCR för VWF och ytterligare markörer med fördesignade TaqMan®-analyser (ThermoFisher Scientific), normaliserade till GAPDH eller andra huskapsgener.

Analys begränsad till ECFC isolerade från grupp B-patienter och utvalda kontroller:

Angiogenesanalys kommer att utföras med Matrigel (Corning). ECFC som erhållits från friska volontärer kommer att användas för att etablera analysförhållandena och kommer att fungera som referens för analysen av ECFC isolerade från patienter.

Analys begränsad till ECFC isolerade från grupp C och utvalda kontroller: undergruppsstudie:

Hämning av den muterade allelen med små interfererande RNA (siRNA) kommer att utföras på en patient utvald baserat på den specifika genetiska defekten (typ 2A-mutation). ECFC från denna patient kommer att transfekteras med en anpassad siRNA riktad mot den muterade allelen, medan en kommersiell VWF-specifik siRNA och en negativ kontroll-siRNA kommer att användas som kontroller på både typ 2A-ECFC och friska volontärhärledda ECFC. Alla ECFC-procedurer kommer att upprepas efter siRNA-tystnad, och resultaten kommer att jämföras med de som erhållits från friska kontroll-ECFC.

Dataanalys Kontinuerliga variabler kommer att rapporteras som median och interkvartilavstånd, medan kategoriska variabler kommer att presenteras som antal och procent. Laboratorieresultat kommer att uttryckas som medelvärde och standardavvikelse. Jämförelser kommer att utföras med envägs ANOVA eller Kruskal-Wallis-test, beroende på om variablerna följer en normal eller icke-normal fördelning. Ett p-värde <0,05 kommer att betraktas som statistiskt signifikant.

Korrelationsanalyser mellan VWF mRNA-uttrycksnivåer och VWF som utsöndrats i cellmedia, celllysat och motsvarande plasma-VWF-nivåer kommer att genomföras med Pearsons eller Spearmans rangkorrelation, som lämpligt.

När tillgängligt kommer analyser att utföras med mer än en ECFC-klon från varje rekryterad individ.