Endoteliaaliset siirtokuntia muodostavat solut potilailla, joilla on VWD, AVWS ja terveillä koehenkilöillä (ECFCs/2022)

Tutkimuksen tavoitteena on luoda viiteväestö endoteelisiä siirtokykyisiä soluista (ECFC) terveistä henkilöistä ja verrata niitä potilaista, joilla on VWD/AVWS, peräisin oleviin ECFC-soluihin.

Tämä vertailu auttaa tunnistamaan VWF:n laadullisiin ja määrällisiin puutteisiin liittyviä solullisia ja molekyylisiä muutoksia. Löydöksiä verrataan kliinisiin ja biokemiallisiin tietoihin sairauden mekanismien selventämiseksi.

Tutkimussuunnitelma: Tämä on kansallinen, monokeskeinen, ei-farmakologinen tutkimus, jonka on aloittanut Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico ja jota koordinoi SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Osallistujien valinta: Potilaat, joilla on aiempi VWD- tai AVWS-diagnoosi ja jotka on ohjattu Angelo Bianchi Bonomin hemofilia- ja tromboosikeskukseen, otetaan yhteyttä suunniteltua osallistumista varten. Historiallisia kliinisiä, biokemiallisia ja molekyylisiä tietoja tarkastellaan, tietoon perustuva suostumus otetaan ja tutkimukseen erityinen verinäyte kerätään VWF-tasojen vahvistamiseksi ja ECFC-solujen eristämiseksi.

Terveet vapaaehtoiset, joilla ei ole aiempaa verenvuoto- tai tromboosihistoriaa, valitaan määrältään yhtä suureen ryhmään kuin potilasryhmä. Lyhyen terveyshaastattelun ja tietoon perustuvan suostumuksen jälkeen heille suoritetaan samat verenoton menettelyt kuin potilaille.

Näytteenkeräys:

Osallistujille suoritetaan verenotto seuraavia menettelyitä varten:

• Kahdeksan millilitraa plasmaa natriumsitraatissa jaotellaan ja säilytetään -80 °C:ssa. Näitä näytteitä käytetään potilaiden diagnoosien vahvistamiseen ja verrokkiryhmässä VWF-tasojen mittaamiseen.
• Geneettinen analyysi: yksi sitraattiputki kerätään synnynnäisistä potilaista, joilla ei ole aiempaa molekyylikarakterisointia.
• Yhteensä 50 ml verta litiumhepariinissa otetaan ECFC-solujen eristämiseksi aiemmin julkaistun protokollan mukaisesti. Eristysmenettely suoritetaan 3 tunnin kuluessa näytteenkeräyksestä. Jos eristys ei onnistu, osallistujilta voidaan pyytää toista ja viimeistä verenottoa.

Plasmanäytteiden testaus kaikille osallistujille: kaikille osallistujille suoritetaan standardi plasmatestaus, mukaan lukien VWF-antigeeni, FVIII-aktiivisuus, VWF-aktiivisuus (VWF:RCo tai VWF:GPIbR), VWF-kollageenin sitoutumisaktiivisuus ja VWF-propeptidi.

Matalaresoluutioinen VWF-multimeerianalyysi suoritetaan joko omalla menetelmällä tai puoliautomaattisella järjestelmällä.

ECFC-soluille suoritettavat menettelyt (kaikille osallistujille):

• ECFC-solujen eristys noudattaa Martin-Ramirez ym. protokollan muokattua versiota (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Virtausytometria suoritetaan endoteelilinjan vahvistamiseksi.
• Konfokaalinen immunofluoresenssimikroskopia suoritetaan istuttamalla ECFC-solut rotan hännän tyypin I-kollageenilla päällystetyille lasiliuskoille. Valitut merkkiaineet sisältävät DAPI:n tumille, VWF:n ja muita endoteelimerkkiaineita.
• Perus- ja stimuloitu VWF-eritys (histamiinin tai PMA:n altistuksen jälkeen) arvioidaan mittaamalla VWF:Ag-tasot kasvatusliuoksissa ja solulysaateissa käyttäen omaa ELISA-menetelmää.
• VWF-multimeerianalyysi suoritetaan käyttäen samaa menettelyä kuin plasmanäytteille.
• RNA-ilmentymisanalyysi sisältää RNA-eristyksen, ensimmäisen ketjun cDNA-synteesin ja kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n VWF:lle ja lisämerkkiaineille käyttäen ennalta suunniteltuja TaqMan®-testejä (ThermoFisher Scientific), normalisoituna GAPDH:hen tai muihin kotitalousgeeneihin.

Testaus rajoitettu ryhmän B potilaista ja valituista verrokeista eristetyille ECFC-soluille:

Angiogeneesitesti suoritetaan käyttäen Matrigeliä (Corning). Terveistä vapaaehtoisista saatuja ECFC-soluja käytetään testiolosuhteiden vakiinnuttamiseen ja ne toimivat viitteinä potilaista eristettyjen ECFC-solujen analysoinnissa.

Testaus rajoitettu ryhmän C ja valituista verrokeista eristetyille ECFC-soluille: alaryhmätutkimus:

Mutanttialleelin estäminen käyttäen pientä häiritsevää RNA:ta (siRNA) suoritetaan potilaalla, joka valitaan perustuen spesifiseen geneettiseen vikaan (tyyppi 2A-mutaatio). Tämän potilaan ECFC-solut transfektoidaan räätälöidyllä siRNA:lla, joka kohdistuu mutanttialleeliin, kun taas kaupallista VWF-spesifistä siRNA:ta ja negatiivista kontrolli-siRNA:ta käytetään kontrollina sekä tyyppi 2A ECFC-soluille että terveistä vapaaehtoisista peräisin oleville ECFC-soluille. Kaikki ECFC-menettelyt toistetaan siRNA-vaimennuksen jälkeen, ja tuloksia verrataan terveistä verrokkiryhmän ECFC-soluista saatujen tuloksiin.

Tietojen analyysi Jatkuvat muuttujat raportoidaan mediaanina ja kvartiilivälinä, kun taas luokitellut muuttujat esitetään lukumäärinä ja prosentteina. Laboratoriotulokset ilmaistaan keskiarvona ja keskihajontana. Vertailut suoritetaan käyttäen yksisuuntaista ANOVA- tai Kruskal-Wallis-testejä riippuen siitä, noudattavatko muuttujat normaalijakaumaa vai epänormaalijakaumaa. P-arvo <0,05 katsotaan tilastollisesti merkitseväksi.

Korrelaatioanalyysit VWF mRNA-ilmentymistasojen ja VWF:n, joka erittyy soluviljelmien liuoksiin, solulysaateisiin ja vastaaviin plasman VWF-tasoihin, välillä suoritetaan käyttäen Pearsonin tai Spearmanin järjestyskorrelaatiota tarpeen mukaan.

Kun saatavilla, analyysit suoritetaan käyttäen useampaa kuin yhtä ECFC-klonia kustakin osallistujasta.