Células Formadoras de Colonias Endoteliales en Pacientes con VWD, AVWS y Sujetos Sanos (ECFCs/2022)

El estudio tiene como objetivo establecer una población de referencia de células formadoras de colonias endoteliales (ECFCs) de sujetos sanos y compararlas con ECFCs derivadas de pacientes con VWD/AVWS.

Esta comparación ayudará a identificar alteraciones celulares y moleculares subyacentes a los defectos cualitativos y cuantitativos del VWF. Los hallazgos se correlacionarán con datos clínicos y bioquímicos para clarificar los mecanismos de la enfermedad.

Diseño del estudio: Este es un estudio nacional, monocéntrico, no farmacológico promovido por la Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico y coordinado por la SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Inclusión: Se contactará para su inclusión programada a pacientes con diagnóstico previo de VWD o AVWS derivados al Centro de Hemofilia y Trombosis Angelo Bianchi Bonomi. Se revisarán los datos clínicos, bioquímicos y moleculares históricos, se obtendrá el consentimiento informado y se recogerá una muestra de sangre específica del estudio para confirmar los niveles de VWF y aislar ECFCs.

Se incluirá un número igual de voluntarios sanos sin antecedentes de trastornos hemorrágicos o trombóticos al del grupo de pacientes. Tras una breve entrevista de salud y la obtención del consentimiento informado, se someterán a los mismos procedimientos de extracción de sangre que los pacientes.

Recogida de muestras:

Los participantes se someterán a una extracción de sangre para los siguientes procedimientos:

• Se alicuotarán y almacenarán a -80 °C ocho mililitros de plasma en citrato sódico. Estas muestras se utilizarán para confirmar los diagnósticos de los pacientes y, para los controles, para medir los niveles de VWF.
• Análisis genético: se recogerá un tubo de citrato para pacientes congénitos sin caracterización molecular previa.
• Se extraerá un total de 50 ml de sangre en heparina de litio para el aislamiento de ECFCs siguiendo el protocolo previamente publicado. El procedimiento de aislamiento se realizará en un plazo de 3 horas desde la recogida de la muestra. En caso de aislamiento fallido, se podrá solicitar a los participantes una segunda y última extracción de sangre.

Pruebas de muestra de plasma comunes a todos los sujetos incluidos: todos los sujetos incluidos se someterán a pruebas plasmáticas estándar, incluyendo antígeno de VWF, actividad de FVIII, actividad de VWF (VWF:RCo o VWF:GPIbR), actividad de unión al colágeno de VWF y propéptido de VWF.

El análisis de multímeros de VWF de baja resolución se realizará utilizando el método interno o el sistema semiautomático.

Procedimiento a realizar en ECFCs (común a todos los sujetos incluidos):

• El aislamiento de ECFCs seguirá una versión modificada del protocolo de Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Se realizará citometría de flujo para confirmar el linaje endotelial.
• Se realizará microscopía de inmunofluorescencia confocal sembrando ECFCs en portaobjetos de vidrio recubiertos de colágeno tipo I de cola de rata. Los marcadores seleccionados incluirán DAPI para núcleos, VWF y otros marcadores endoteliales.
• La secreción basal y estimulada de VWF (tras exposición a histamina o PMA) se evaluará midiendo los niveles de VWF:Ag en medios de cultivo y lisados celulares mediante un ELISA interno.
• El análisis multimérico de VWF se realizará utilizando el mismo procedimiento aplicado a las muestras de plasma.
• El análisis de expresión de ARN incluirá el aislamiento de ARN, la síntesis de ADNc de primera cadena y la PCR cuantitativa en tiempo real para VWF y marcadores adicionales utilizando ensayos TaqMan® prediseñados (ThermoFisher Scientific), normalizados a GAPDH u otros genes de mantenimiento.

Ensayo limitado a ECFCs aisladas de pacientes del grupo B y controles seleccionados:

Se realizará un ensayo de angiogénesis utilizando Matrigel (Corning). Las ECFCs obtenidas de voluntarios sanos se utilizarán para establecer las condiciones del ensayo y servirán como referencia para el análisis de ECFCs aisladas de pacientes.

Ensayo limitado a ECFCs aisladas del grupo C y controles seleccionados: subestudio:

Se realizará la inhibición del alelo mutante utilizando ARN de interferencia pequeño (siRNA) en un paciente seleccionado basándose en el defecto genético específico (mutación tipo 2A). Las ECFCs de este paciente se transfectarán con un siRNA personalizado dirigido al alelo mutante, mientras que se utilizará un siRNA comercial específico de VWF y un siRNA de control negativo como controles tanto en ECFCs tipo 2A como en ECFCs derivadas de voluntarios sanos. Todos los procedimientos de ECFCs se repetirán tras el silenciamiento con siRNA, y los resultados se compararán con los obtenidos de ECFCs de control sanas.

Análisis de datos: Las variables continuas se reportarán como mediana y rango intercuartílico, mientras que las variables categóricas se presentarán como recuentos y porcentajes. Los resultados de laboratorio se expresarán como media y desviación estándar. Las comparaciones se realizarán utilizando pruebas ANOVA de un factor o de Kruskal-Wallis, dependiendo de si las variables siguen una distribución normal o no normal. Se considerará estadísticamente significativo un valor de p <0.05.

Los análisis de correlación entre los niveles de expresión de ARNm de VWF y el VWF secretado en medios celulares, lisados celulares y los niveles plasmáticos de VWF correspondientes se llevarán a cabo utilizando la correlación de Pearson o el coeficiente de correlación por rangos de Spearman, según corresponda.

Cuando estén disponibles, los análisis se realizarán utilizando más de un clon de ECFCs de cada sujeto incluido.