Endoteliální kolonie tvořící buňky u pacientů s VWD, AVWS a zdravých jedinců (ECFCs/2022)

Cílem studie je vytvořit referenční populaci endoteliálních kolonie-tvorných buněk (ECFC) od zdravých jedinců a porovnat je s ECFC získanými od pacientů s VWD/AVWS.

Toto srovnání pomůže identifikovat buněčné a molekulární změny, které stojí za kvalitativními a kvantitativními defekty VWF. Zjištění budou korelována s klinickými a biochemickými údaji, aby se objasnily mechanismy onemocnění.

Design studie: Jedná se o národní, monocentrickou, nefarmakologickou studii, kterou podporuje Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico a koordinuje SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Zařazování: Pacienti s předchozí diagnózou VWD nebo AVWS, kteří byli odesláni do Centra pro hemofilii a trombózu Angelo Bianchi Bonomi, budou kontaktováni pro plánované zařazení. Budou přezkoumány historické klinické, biochemické a molekulární údaje, získáno informovaný souhlas a odebrán vzorek krve specifický pro studii k potvrzení hladin VWF a izolaci ECFC.

Zdraví dobrovolníci bez anamnézy krvácivých nebo trombotických poruch budou zařazeni v počtu rovném pacientům. Po krátkém zdravotním pohovoru a informovaném souhlasu podstoupí stejné odběry krve jako pacienti.

Odběr vzorků:

Účastníci podstoupí odběr krve pro následující postupy:

• Osm mililitrů plazmy v citrátu sodném bude rozděleno na alikvoty a skladováno při -80 °C. Tyto vzorky budou použity k potvrzení diagnózy pacientů a u kontrolních osob k měření hladin VWF.
• Genetická analýza: u pacientů s vrozenou poruchou bez předchozí molekulární charakterizace bude odebrána jedna zkumavka s citrátem.
• Celkem 50 ml krve v lithiovém heparinu bude odebráno pro izolaci ECFC podle dříve publikovaného protokolu. Izolační postup bude proveden do 3 hodin od odběru vzorku. V případě neúspěšné izolace mohou být účastníci požádáni o druhý a poslední odběr krve.

Testování vzorků plazmy společné pro všechny zařazené subjekty: všichni zařazení subjekty podstoupí standardní testování plazmy, včetně antigenu VWF, aktivity FVIII, aktivity VWF (VWF:RCo nebo VWF:GPIbR), kolagen-vazebné aktivity VWF a propeptidu VWF.

Analýza multimerů VWF s nízkým rozlišením bude provedena buď pomocí vlastní metody, nebo poloautomatizovaného systému.

Postup, který bude proveden na ECFC (společný pro všechny zařazené subjekty):

• Izolace ECFC bude následovat upravenou verzi protokolu Martina-Ramireze a kol. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Bude provedena průtoková cytometrie k potvrzení endoteliální linie.
• Bude provedena konfokální imunofluorescenční mikroskopie nanesením ECFC na skleněné podložky potažené kolagenem typu I z krysího ocasu. Vybrané markery budou zahrnovat DAPI pro jádra, VWF a další endoteliální markery.
• Bazální a stimulovaná sekrece VWF (po expozici histaminu nebo PMA) bude hodnocena měřením hladin VWF:Ag v kultivačních médiích a buněčných lyzátech pomocí vlastního ELISA.
• Analýza multimerů VWF bude provedena pomocí stejného postupu aplikovaného na vzorky plazmy.
• Analýza exprese RNA bude zahrnovat izolaci RNA, syntézu cDNA prvního řetězce a kvantitativní PCR v reálném čase pro VWF a další markery pomocí předpřipravených testů TaqMan® (ThermoFisher Scientific), normalizovaných na GAPDH nebo jiné housekeeping geny.

Test omezený na ECFC izolované od pacientů skupiny B a vybraných kontrol:

Angiogenezní test bude proveden pomocí Matrigelu (Corning). ECFC získané od zdravých dobrovolníků budou použity k nastavení podmínek testu a budou sloužit jako reference pro analýzu ECFC izolovaných od pacientů.

Test omezený na ECFC izolované od skupiny C a vybraných kontrol: podskupinová studie:

Inhibice mutantní alely pomocí malé interferující RNA (siRNA) bude provedena u pacienta vybraného na základě specifického genetického defektu (mutace typu 2A). ECFC od tohoto pacienta budou transfekovány přizpůsobenou siRNA cílící na mutantní alelu, zatímco komerční VWF-specifická siRNA a negativní kontrolní siRNA budou použity jako kontroly jak na ECFC typu 2A, tak na ECFC odvozené od zdravých dobrovolníků. Všechny postupy s ECFC budou po siRNA umlčení opakovány a výsledky budou porovnány s výsledky získanými od ECFC zdravých kontrol.

Analýza dat: Spojité proměnné budou uvedeny jako medián a interkvartilové rozpětí, zatímco kategorické proměnné budou prezentovány jako počty a procenta. Laboratorní výsledky budou vyjádřeny jako průměr a směrodatná odchylka. Srovnání budou provedena pomocí jednosměrné ANOVA nebo Kruskal-Wallis testů, v závislosti na tom, zda proměnné sledují normální nebo nenormální rozdělení. Hodnota p <0,05 bude považována za statisticky významnou.

Korelační analýzy mezi hladinami exprese mRNA VWF a VWF vylučovaného v buněčném médiu, buněčných lyzátech a odpovídajícími hladinami VWF v plazmě budou provedeny pomocí Pearsonovy nebo Spearmanovy pořadové korelace, podle vhodnosti.

Pokud budou k dispozici, analýzy budou provedeny s více než jedním klonem ECFC od každého zařazeného subjektu.