VWD, AVWS 환자 및 건강한 대조군의 내피세포 집락형성세포 (ECFCs/2022)
폰빌레브란트병, 획득성 폰빌레브란트 증후군 환자 및 건강한 대조군에서 내피 집락 형성 세포(ECFCs)의 분리 및 특성 분석
연구 개요
상태
상세 설명
본 연구는 건강한 대상자로부터 내피세포 집락 형성 세포(ECFCs)의 기준 집단을 확립하고 이를 VWD/AVWS 환자 유래 ECFCs와 비교하는 것을 목표로 합니다.
이 비교는 질적 및 양적 VWF 결함의 기저에 있는 세포 및 분자적 변화를 규명하는 데 도움이 될 것입니다. 연구 결과는 임상 및 생화학적 데이터와 상관 분석되어 질병 기전을 명확히 하는 데 활용될 것입니다.
연구 설계: 이는 Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico가 주도하고 SC Medicina - Emostasi e Trombosi가 조정하는 전국적, 단일 기관, 비약물 연구입니다.
등록: VWD 또는 AVWS의 기존 진단을 받은 환자 중 Angelo Bianchi Bonomi 혈우병 및 혈전증 센터에 의뢰된 환자는 예정된 등록을 위해 접촉될 것입니다. 과거의 임상, 생화학 및 분자 데이터를 검토하고, 동의서를 취득한 후, VWF 수치를 확인하고 ECFCs를 분리하기 위한 연구 특정 혈액 샘플을 채취할 것입니다.
출혈 또는 혈전성 장애 병력이 없는 건강한 자원봉사자는 환자 그룹과 동일한 수로 등록될 것입니다. 간단한 건강 인터뷰와 동의서 취득 후, 그들은 환자와 동일한 채혈 절차를 거칠 것입니다.
샘플 수집:
참가자는 다음 절차를 위해 채혈을 받게 됩니다:
- 시트르산 나트륨에 8밀리리터의 혈장을 분주하여 -80°C에 보관합니다. 이 샘플들은 환자의 진단을 확인하고, 대조군의 경우 VWF 수치를 측정하는 데 사용될 것입니다.
- 유전자 분석: 이전 분자 특성화가 없는 선천성 환자의 경우 시트르산 튜브 1개를 채취합니다.
- ECFC 분리를 위해 리튬 헤파린에 총 50ml의 혈액을 채취하며, 이전에 발표된 프로토콜에 따라 진행됩니다. 분리 절차는 샘플 수집 후 3시간 이내에 수행됩니다. 분리가 성공하지 못한 경우, 참가자는 두 번째이자 마지막 채혈을 요청받을 수 있습니다.
모든 등록 대상자에게 공통으로 수행되는 혈장 샘플 검사: 모든 등록 대상자는 표준 혈장 검사를 받게 되며, 여기에는 VWF 항원, FVIII 활성, VWF 활성(VWF:RCo 또는 VWF:GPIbR), VWF 콜라겐 결합 활성 및 VWF 프로펩타이드가 포함됩니다.
저해상도 VWF 멀티머 분석은 자체 개발 방법 또는 반자동 시스템을 사용하여 수행됩니다.
ECFCs에 수행될 절차 (모든 등록 대상자에게 공통):
- ECFC 분리는 Martin-Ramirez 등(Nat Protoc. 2012;7:1709-1715)의 프로토콜을 수정한 버전에 따라 진행됩니다.
- 내피 계통을 확인하기 위해 유세포 분석이 수행됩니다.
- 쥐 꼬리 콜라겐 타입 I로 코팅된 유리 슬라이드에 ECFCs를 도말하여 공초점 면역형광 현미경 검사를 수행합니다. 선택된 마커에는 핵을 위한 DAPI, VWF 및 기타 내피 마커가 포함됩니다.
- 기저 및 자극된 VWF 분비(히스타민 또는 PMA 노출 후)는 자체 개발 ELISA를 사용하여 배양 배지 및 세포 용해물의 VWF:Ag 수치를 측정하여 평가됩니다.
- VWF 멀티머 분석은 혈장 샘플에 적용된 동일한 절차를 사용하여 수행됩니다.
- RNA 발현 분석에는 RNA 분리, 제1가닥 cDNA 합성 및 사전 설계된 TaqMan® 분석(ThermoFisher Scientific)을 사용한 VWF 및 추가 마커에 대한 정량적 실시간 PCR이 포함되며, GAPDH 또는 기타 내부 대조 유전자로 정규화됩니다.
B군 환자 및 선별된 대조군에서 분리된 ECFCs에만 제한된 분석:
혈관생성 분석은 Matrigel(Corning)을 사용하여 수행됩니다. 건강한 자원봉사자로부터 얻은 ECFCs는 분석 조건을 확립하는 데 사용되며 환자로부터 분리된 ECFCs의 분석을 위한 기준으로 활용될 것입니다.
C군 및 선별된 대조군에서 분리된 ECFCs에만 제한된 분석: 하위 그룹 연구:
소분자 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 돌연변이 대립유전자 억제는 특정 유전적 결함(2A형 돌연변이)을 기반으로 선별된 환자에서 수행됩니다. 이 환자의 ECFCs는 돌연변이 대립유전자를 표적으로 하는 맞춤형 siRNA로 형질전환되며, 상용 VWF 특이적 siRNA와 음성 대조 siRNA는 2A형 ECFCs 및 건강한 자원봉사자 유래 ECFCs 모두에서 대조군으로 사용될 것입니다. 모든 ECFC 절차는 siRNA 침묵 후 반복되며, 결과는 건강한 대조군 ECFCs에서 얻은 결과와 비교될 것입니다.
데이터 분석 연속 변수는 중앙값 및 사분위 범위로 보고되며, 범주형 변수는 빈도 및 백분율로 제시됩니다. 실험실 결과는 평균 및 표준 편차로 표현됩니다. 비교는 변수가 정규 또는 비정규 분포를 따르는지에 따라 일원 분산 분석 또는 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 수행됩니다. p값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.
VWF mRNA 발현 수준과 세포 배지 및 세포 용해물에서 분비된 VWF 및 해당 혈장 VWF 수준 간의 상관 분석은 적절하게 Pearson 또는 Spearman 순위 상관을 사용하여 수행됩니다.
가능한 경우, 각 등록 대상자로부터 둘 이상의 ECFC 클론을 사용하여 분석이 수행될 것입니다.
연구 유형
등록 (추정된)
연락처 및 위치
연구 연락처
- 이름: Flora Peyvandi, MD, PhD
- 전화번호: +39 02-55035414
- 이메일: flora.peyvandi@policlinico.mi.it
연구 장소
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Milan, 이탈리아, 20122
- 모병
- Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, A.B.Bonomi Hemophilia and Thrombosis Center
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연락하다:
- Flora Peyvandi, MD, PhD
- 전화번호: +39 02-55035414
- 이메일: flora.peyvandi@policlinico.mi.it
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참여기준
자격 기준
공부할 수 있는 나이
- 어린이
- 성인
- 고령자
건강한 자원 봉사자를 받아들입니다
샘플링 방법
연구 인구
이 연구는 이전에 VWD 또는 AVWS 진단을 받은 피험자와 건강한 자원봉사자(대조군) 그룹의 등록을 포함합니다. 환자는 이전에 VWD 또는 AVWS 진단을 받은 Angelo Bianchi Bonomi 혈우병 및 혈전증 센터에 의뢰된 사람들 중에서 선정됩니다.
출혈 또는 혈전 장애의 이전 진단을 받지 않은 개인으로 정의되는 건강한 자원봉사자는 ECFC 기준 그룹을 만들기 위해 사례와 동일한 수로 등록됩니다. 등록 시 대조군은 건강 상태를 확인하기 위한 인터뷰를 진행하고, 동의서에 서명한 후, 이미 환자에 대해 설명된 바와 같이 혈장 VWF 수치를 확인하고 ECFC를 분리하는 데 필요한 채혈을 받게 됩니다.
설명
환자 포함 기준:
폰빌레브란트병(VWD) 또는 후천성 폰빌레브란트 증후군(AVWS) 환자
연령 ≥ 16세.
폰빌레브란트병 또는 후천성 폰빌레브란트 증후군의 기존 진단, 다음 중 하나로 정의됨:
그룹 A - 1형 VWD:
출혈 병력과 관계없이 VWF 수준 ≤ 30 IU/dL, 또는
비정상적 출혈이 있는 경우 VWF 수준 ≤ 0.50 IU/mL.
그룹 B - 선천성 또는 후천성 VWD (VWD 또는 AVWS):
위장관 출혈 유무에 관계없이 선천성 또는 후천성 VWD 진단.
그룹 C - 하위 그룹 연구 (2A형 VWD):
돌연변이 대립유전자의 대립유전자 특이적 siRNA 침묵을 포함하는 전용 하위 연구에 선택된 2A형 VWD 환자 1명.
서면 동의서를 작성할 능력과 의지.
이전 분자 특성화가 없는 환자의 경우: VWF 유전자 시퀀싱을 받고 관련 동의서에 서명할 의지.
건강한 지원자 포함 기준
- VWD, 출혈 장애 또는 혈전성 장애의 기존 진단 없음.
- 연구 절차를 위해 혈액 기증 의지.
- 서면 동의서를 작성할 능력과 의지.
- 연령 ≥ 18세.
환자 및 건강한 지원자 모두에 대한 제외 기준:
- 임신.
- 선별 검사 또는 병력에 따라 결정된 빈혈.
공부 계획
연구는 어떻게 설계됩니까?
디자인 세부사항
코호트 및 개입
그룹/코호트 |
개입 / 치료 |
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폰빌레브란트병/ 후천성 폰빌레브란트병 환자
VWD 또는 AVWS 확진 환자.
참가자는 혈장 VWF 측정 및 ECFCs 분리 및 특성 분석을 위한 말초혈액 샘플 채취를 진행합니다.
이전 분자 특성 분석이 없는 VWD 환자의 경우, 유전자 분석을 위한 추가 혈액 샘플이 채취됩니다.
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혈장 샘플은 VWF 수치 측정을 위해 수집됩니다.
혈액 샘플을 수집하여 ECFC를 분리하고 이에 대한 후속 특성 분석을 수행합니다.
분자학적 특성이 이전에 확인되지 않은 VWD 환자의 경우 VWF 유전자 검사를 위해 추가 혈액 샘플이 채취됩니다.
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건강한 기증자
출혈이나 혈전성 장애의 개인적 또는 가족력이 없는 건강한 지원자들이 연구의 참조 인구로 참여합니다.
참가자들은 말초혈액 샘플 채취, 혈장 VWF 측정 및 ECFCs 분리 및 특성 분석을 거치게 됩니다.
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혈장 샘플은 VWF 수치 측정을 위해 수집됩니다.
혈액 샘플을 수집하여 ECFC를 분리하고 이에 대한 후속 특성 분석을 수행합니다.
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연구는 무엇을 측정합니까?
주요 결과 측정
결과 측정 |
측정값 설명 |
기간 |
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ECFCs 분리 및 특성 분석
기간: 등록 시작 후 42주
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VWD 또는 AVWS 환자와 건강한 대조군에서 유래한 ECFCs 간의 차이 평가. ECFCs에 의한 기저 및 자극된 VWF 생산 및 분비, 여기에는 배양 배지와 세포 용해물의 기저 VWF 수준 및 생물학적 또는 화학적 화합물에 노출 후 자극된 VWF 방출이 포함되며, ELISA(IU/dL)로 측정하고 VWD/AVWS 환자와 건강한 대조군 간에 비교. ECFCs에서의 VWF mRNA 발현 수준, 정량적 실시간 PCR로 평가하고 ΔΔCt로 표현, VWD/AVWS 환자와 건강한 대조군 간에 비교. |
등록 시작 후 42주
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2차 결과 측정
결과 측정 |
측정값 설명 |
기간 |
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ECFC VWF 항원 단백질 및 mRNA 수준과 혈장 및 혈소판 VWF 항원/활성 수준 및 분자 결함의 상관관계.
기간: 등록 시작 후 42주
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VWD, AVWS 환자 및 건강한 대조군에서 ECFC 유래 VWF 파라미터와 순환 VWF 수준 간의 상관관계 분석.
ELISA로 측정된 배양 배지 및 세포 용해물의 ECFC 유래 VWF 항원 수준(IU/dL)과 정량적 실시간 PCR로 평가된 ECFC의 VWF mRNA 발현 수준(ΔΔCt)은 혈장 및 혈소판 VWF 항원 및 활성 수준(IU/dL)과 상관관계를 분석합니다.
모든 ECFC 유래 및 순환 VWF 파라미터는 추가적으로 특정 기저 분자 결손과의 관련성을 분석합니다.
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등록 시작 후 42주
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VWD/AVWS 환자와 건강한 대조군의 ECFCs 혈관신생 특성 비교
기간: 등록 시작 후 42주
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ECFC의 혈관신생 특성은 in vitro Matrigel 튜브 형성 분석을 사용하여 평가되며, 제2형 또는 제3형 VWD 또는 AVWS 환자와 건강한 대조군 간에 비교될 것입니다.
정량적 매개변수에는 총 튜브 길이(μm), 튜브 수, 분기 수 및 메쉬 수가 포함됩니다.
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등록 시작 후 42주
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2A형 폰빌레브란트병에서 정상 VWF 수준 회복을 위한 대립유전자 특이 siRNA 평가
기간: 등록 시작부터 42주
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제2A형 폰빌레브란트병 환자로부터 유래한 내피세포 ECFC에서 대립유전자 특이적 siRNA를 평가하여 돌연변이 대립유전자의 선택적 억제가 정상적인 VWF 발현과 분비를 회복시키는지 평가할 것입니다.
모든 분석은 siRNA 형질전환 전후에 수행될 것입니다.
다음 매개변수를 평가할 것입니다: 정량적 실시간 PCR로 평가하고 ΔΔCt(상대적 발현)로 표현되는 VWF mRNA 발현 수준; ELISA(IU/mL)로 측정된 ECFC 배양 배지 내 VWF 단백질 수준.
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등록 시작부터 42주
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공동 작업자 및 조사자
연구 기록 날짜
연구 주요 날짜
연구 시작 (실제)
기본 완료 (추정된)
연구 완료 (추정된)
연구 등록 날짜
최초 제출
QC 기준을 충족하는 최초 제출
처음 게시됨 (실제)
연구 기록 업데이트
마지막 업데이트 게시됨 (실제)
QC 기준을 충족하는 마지막 업데이트 제출
마지막으로 확인됨
추가 정보
이 연구와 관련된 용어
추가 관련 MeSH 약관
기타 연구 ID 번호
- 3387 n.6569
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