Cellule Endoteliali Formanti Colonie in Pazienti con VWD, AVWS e Soggetti Sani (ECFCs/2022)

Lo studio mira a stabilire una popolazione di riferimento di cellule endoteliali formanti colonie (ECFC) da soggetti sani e confrontarle con ECFC derivate da pazienti con VWD/AVWS.

Questo confronto aiuterà a identificare alterazioni cellulari e molecolari alla base dei difetti qualitativi e quantitativi del VWF. I risultati saranno correlati con dati clinici e biochimici per chiarire i meccanismi della malattia.

Disegno dello studio: Questo è uno studio nazionale, monocentrico, non farmacologico promosso dalla Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico e coordinato dalla SC Medicina - Emostasi e Trombosi.

Arruolamento: I pazienti con diagnosi precedente di VWD o AVWS riferiti al Centro Emofilia e Trombosi Angelo Bianchi Bonomi saranno contattati per l'arruolamento programmato. Saranno esaminati i dati clinici, biochimici e molecolari storici, verrà ottenuto il consenso informato e verrà raccolto un campione di sangue specifico per lo studio per confermare i livelli di VWF e isolare le ECFC.

Volontari sani senza storia di disturbi emorragici o trombotici saranno arruolati in numero uguale a quello del gruppo di pazienti. Dopo un breve colloquio sanitario e il consenso informato, subiranno le stesse procedure di prelievo di sangue dei pazienti.

Raccolta dei campioni:

I partecipanti subiranno prelievo di sangue per le seguenti procedure:

• Otto millilitri di plasma in citrato di sodio saranno aliquote e conservati a -80 °C. Questi campioni saranno utilizzati per confermare le diagnosi dei pazienti e, per i controlli, per misurare i livelli di VWF.
• Analisi genetica: verrà raccolta una provetta di citrato per pazienti congeniti senza precedente caratterizzazione molecolare.
• Verrà prelevato un totale di 50 ml di sangue in eparina litio per l'isolamento delle ECFC seguendo il protocollo precedentemente pubblicato. La procedura di isolamento sarà eseguita entro 3 ore dalla raccolta del campione. In caso di isolamento non riuscito, ai partecipanti potrebbe essere chiesto di sottoporsi a un secondo e ultimo prelievo di sangue.

Test sui campioni di plasma comuni a tutti i soggetti arruolati: tutti i soggetti arruolati subiranno test plasmatici standard, inclusi antigene del VWF, attività del FVIII, attività del VWF (VWF:RCo o VWF:GPIbR), attività legante al collagene del VWF e propeptide del VWF.

L'analisi multimera del VWF a bassa risoluzione sarà eseguita utilizzando il metodo interno o il sistema semiautomatico.

Procedura da eseguire sulle ECFC (comune a tutti i soggetti arruolati):

• L'isolamento delle ECFC seguirà una versione modificata del protocollo di Martin-Ramirez et al. (Nat Protoc. 2012;7:1709-1715).
• Sarà eseguita la citometria a flusso per confermare la linea endoteliale.
• Sarà eseguita la microscopia a immunofluorescenza confocale piastrando le ECFC su vetrini rivestiti con collagene di tipo I di coda di ratto. I marcatori selezionati includeranno DAPI per i nuclei, VWF e altri marcatori endoteliali.
• La secrezione basale e stimolata del VWF (dopo esposizione a istamina o PMA) sarà valutata misurando i livelli di VWF:Ag nei mezzi di coltura e nei lisati cellulari utilizzando un ELISA interno.
• L'analisi multimera del VWF sarà eseguita utilizzando la stessa procedura applicata ai campioni di plasma.
• L'analisi dell'espressione dell'RNA includerà l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA a primo filamento e la PCR quantitativa in tempo reale per VWF e marcatori aggiuntivi utilizzando saggi TaqMan® pre-progettati (ThermoFisher Scientific), normalizzati rispetto a GAPDH o altri geni domestici.

Saggio limitato alle ECFC isolate da pazienti del gruppo B e controlli selezionati:

Il saggio di angiogenesi sarà eseguito utilizzando Matrigel (Corning). Le ECFC ottenute da volontari sani saranno utilizzate per stabilire le condizioni del saggio e serviranno come riferimento per l'analisi delle ECFC isolate dai pazienti.

Saggio limitato alle ECFC isolate dal gruppo C e controlli selezionati: sottogruppo di studio:

L'inibizione dell'allele mutante utilizzando piccoli RNA interferenti (siRNA) sarà eseguita in un paziente selezionato in base al difetto genetico specifico (mutazione di tipo 2A). Le ECFC di questo paziente saranno trasfettate con un siRNA personalizzato mirato all'allele mutante, mentre un siRNA commerciale specifico per VWF e un siRNA di controllo negativo saranno utilizzati come controlli sia sulle ECFC di tipo 2A che sulle ECFC derivate da volontari sani. Tutte le procedure ECFC saranno ripetute dopo il silenziamento con siRNA e i risultati saranno confrontati con quelli ottenuti dalle ECFC di controllo sane.

Analisi dei dati Le variabili continue saranno riportate come mediana e intervallo interquartile, mentre le variabili categoriali saranno presentate come conteggi e percentuali. I risultati di laboratorio saranno espressi come media e deviazione standard. I confronti saranno eseguiti utilizzando test ANOVA a una via o test di Kruskal-Wallis, a seconda che le variabili seguano una distribuzione normale o non normale. Un valore p <0,05 sarà considerato statisticamente significativo.

Le analisi di correlazione tra i livelli di espressione dell'mRNA del VWF e il VWF secreto nei mezzi cellulari, nei lisati cellulari e i corrispondenti livelli plasmatici di VWF saranno condotte utilizzando la correlazione di Pearson o il rango di Spearman, a seconda dei casi.

Quando disponibili, le analisi saranno eseguite utilizzando più di un clone ECFC da ciascun soggetto arruolato.