ヨーグルト摂取に基づく客観的代謝物マーカーの同定 (YOGBIO)

米国食品医薬品局（FDA）は最近、ヨーグルトと2型糖尿病（T2D）リスク低減に関する適格健康強調表示の申請を承認するのに十分な科学的証拠が堅牢であると判断しました。 対照的に、カナダ保健省は同様の表示をまだ承認していません。 既存の証拠は、自己申告式食事質問票に依存する前向きコホート研究のみに由来しており、これらは検証されているにもかかわらず、証拠の質を損ない規制承認を妨げる可能性のあるランダム誤差および系統誤差の影響を受けます。

食物摂取バイオマーカーは、栄養疫学における客観性を高めるための有用なツールとしてますます認識されています。 メタボロミクス、すなわち血漿代謝物の包括的プロファイリングは、そのようなバイオマーカーを同定するためのゴールドスタンダードと見なされています。 乳製品の文脈では、主要なマイルストーンは、大規模なスペイン人コホートにおけるヨーグルト摂取のメタボロームシグネチャーの同定でした。 このシグネチャー（例えば、ミリスチン酸由来のC14:0スフィンゴミエリンを含む27の代謝物で構成）は、独立した米国人コホートにおいてヨーグルト摂取を予測し、両集団において低いT2D発生率と関連していました。 しかし、このシグネチャーは観察データから導出されたため、ヨーグルト摂取に対する特異性を欠いていました。

このプロジェクトは、ヨーグルト摂取の特異的バイオマーカーを発見し、確立された基準に対してそれらを検証することによって、この重要なギャップを埋めることを目指します。

我々は、一般に健康な成人16名（女性8名、男性8名）を対象とした無作為化クロスオーバー用量反応給食試験を実施します。 この試験は、それぞれ7日間持続し、1週間のウォッシュアウト期間で区切られた、4つの事前に定められた食事で構成されます。 各食事の7日目に、参加者はINAFで混合食負荷試験を受け、食後状態の血漿サンプルを採取します。 4つの食事は、カナダ食品ガイドへの高い順守を反映した乳製品を含まない背景食に基づき、以下の追加を行います：

1. 大豆ベースのプリン125g／2,380kcal／日（すなわち、ヨーグルトを含まない食事）；
2. ヨーグルト90g／2,380kcal／日（すなわち、ヨーグルト0.5基準摂取量／2,380kcal／日）；
3. ヨーグルト175g／2,380kcal／日（すなわち、ヨーグルト1基準摂取量／2,380kcal／日）；
4. ヨーグルト350g／2,380kcal／日（すなわち、ヨーグルト2基準摂取量／2,380kcal／日）。

同定されたバイオマーカーがヨーグルトの多様性を反映することを確実にするために、4種類のヨーグルトを試験します：

a) 無脂肪プレーン通常ヨーグルト； b) 2%乳脂肪プレーン通常ヨーグルト； c) 無脂肪プレーンギリシャヨーグルト； d) 2%乳脂肪プレーンギリシャヨーグルト。 各ヨーグルトタイプは4名の参加者に割り当てられ、参加者は研究を通じて一貫して同じタイプを摂取します。 目的は、各ヨーグルトタイプごとに別個のバイオマーカーを同定することではなく、同定されたバイオマーカーがヨーグルトタイプの多様性を考慮に入れることを確実にすることです。 ヨーグルトを含まない介入については、全参加者が同じ大豆ベースのプリンを摂取します。 参加者は、4つの7日間介入を無作為の順序で完了します。 このデザインにより、血漿メタボロームで観察される変動は、ヨーグルトにのみ帰因することが保証されます。

4つの介入すべてにおいて、すべての食事と食品は、我々のチームが以前に行ったように[28-30]、7日間の循環メニューを使用して提供されます。 各介入の背景食は同一で、乳製品を含まず（すなわち、すべての乳製品とバターを除外）、カナダ食品ガイドへの高い順守を反映するように設計され、最小限に加工された植物性食品を重視します。 受容性と順守性を高めるために、メニューには公式カナダ食品ガイド文書からのレシピを毎日少なくとも1つ含めます[31, 32]。 経験豊富な食品技術者が食事を調理し、すべての食品と材料は0.1g単位で正確に計量されます。 摂取バイオマーカー同定の文脈では、プレーンヨーグルトはフレーバー付きヨーグルトの代わりに最も適切な選択肢と見なされました。 しかし、プレーンヨーグルトは酸味のため、口当たりが劣ります。 これに対処するため、背景食には毎日の少量の果物の摂取が含まれ、参加者はこれをヨーグルト（または大豆プリン）に混ぜるか、一緒に摂取するよう指示されます。 果物の摂取量は標準化され、4つの介入すべてで毎日一貫した量で摂取されるため、ヨーグルトバイオマーカー同定プロセスに交絡を導入しません。 我々は、このアプローチは大豆ベースのプリンを含む食事中のコンプライアンスを確保するのにも有利であると考えます。

4つのヨーグルトタイプと3つの摂取レベル全体で、ヨーグルトは平均120kcal/日を提供し、対照の大豆ベースのプリンも同様です。 最も低いカロリー貢献は40kcal（無脂肪プレーン通常ヨーグルト、90g/日）、最も高いのは240kcal（2%乳脂肪プレーンギリシャヨーグルト；350g/日）です。 これらのカロリーは、2,380kcal/日の背景食に追加され、4つの介入全体で平均2,500kcal/日になる標準化メニューを作成します。 介入がわずか7日間であることを考えると、ヨーグルトまたは大豆ベースのプリンのカロリー貢献の違いが体重に影響を与えたり、交絡を導入したりする可能性は低いです。 提案されたアプローチ（試験食品を同一の等エネルギー背景食に追加する）が最適な戦略です。 単一の参加者にとって、4つの食事の唯一の違いはヨーグルト含有量であり、これにより、食事後の血漿メタボロームのいかなる差異もヨーグルトにのみ帰因することが保証されます。 逆に、4つのフェーズ全体で背景食の総カロリー含量を類似させようとすると、背景食の変更が必要となり、血漿メタボロームにバイアスを導入することになります。 ベースラインでは、参加者のエネルギー必要量は検証済み予測式[33]を使用して推定され、食事の総エネルギー含量はこれらの必要量を満たすように調整されます。

4つの7日間介入のそれぞれにおいて、参加者は臨床研究コーディネーター（CRC）の監督下で、INAFで少なくとも3回の完全な食事を摂取する必要があります。 これらの訪問中に、彼らはまた、次の24〜72時間分の食事を受け取ります。 参加者は、提供された食品のみを摂取し、すべての食事を供給された通りに摂取するよう指示されます。 アルコール、ビタミンサプリメント、自然健康製品は許可されません。 紅茶とコーヒー（1日2杯以下）は許可されますが、毎日の変動はなく、ミルク、クリーム、砂糖は加えません。 水は無制限に許可されます。 参加者は、プロトコル全体を通じて通常の身体活動レベルを安定して維持するよう指示されます。 各食事の7日目に、参加者はヨーグルトバイオマーカーの時間応答性を調べるための急性混合食負荷試験を受けます。 12時間の絶食後、参加者は午前7時30分にINAFに到着します。 試験食は、前日に毎日提供された同じヨーグルト（または大豆ベースのプリン）を含む朝食スムージーで構成されます。 血漿サンプルは、ベースライン（絶食時）および食後1、2、4、6時間に採取されます。 サンプルはEDTA採血管に採取され、-80℃で保存されます。

試験中、参加者は、ケベック州成人を対象とした研究用に特に検証された、検証済み自己管理式ウェブベース24時間食事思い出し法（R24W）を完了するよう指示されます[34-40]。 R24Wの完全な方法論と検証は公表されています[34-40]。 簡単に言えば、R24Wは参加者に、前日に摂取したすべての食品と飲料（アルコールを含む）を示すよう導きます。 R24Wは、構造化された食品リストを閲覧するか、検索エンジンを使用することによって、摂取した食品と飲料を選択することを可能にします。 また、標準化された画像を含み、食事量の評価を支援します。 これらのデータは、R24Wのパフォーマンスをヨーグルトバイオマーカーのパフォーマンスと比較し、食事の真のヨーグルト含有量を推定するために使用されます。

参加者とCRCは食事割り当てについて盲検化できません。 しかし、食事中のヨーグルト（または大豆ベースのプリン）の正確な量は参加者に開示されません。 4つの食事は無作為に文字（例：A=高ヨーグルト、B=大豆、C=低ヨーグルト、D=中程度ヨーグルト）でラベル付けされます。 このアプローチは、各介入終了時のR24W完了に対する情報バイアスを最小限に抑えます。 各介入は1週間のウォッシュアウト期間で区切られ、参加者に休憩を提供し、複数週介入に関連する脱落リスクを低減します。 ウォッシュアウト中、参加者は通常の食事に戻るよう指示されます。 我々は、ウォッシュアウト中の食事の持ち越し効果が、ヨーグルト摂取バイオマーカー同定に関するその後の7日間介入期間に影響を与えることはないと予想します。 実際、ヨーグルト摂取バイオマーカーの同定は、各介入の7日目に採取された血漿サンプル（絶食時および食後状態の両方）を活用します。 したがって、ウォッシュアウト期間中に摂取された食品からのバイオマーカーが、提案されたデザイン[27]の下でヨーグルト摂取バイオマーカーに期待される急性食後応答性を示す可能性は極めて低いです。 試験全体の参加期間は7週間です。 試験終了時、各参加者について、ヨーグルト摂取後に採取された合計15の血漿サンプル（すなわち、5サンプル×3レベルのヨーグルト摂取）と、ヨーグルトを含まない食事後に採取された5サンプルが得られ、合計240のヨーグルト後サンプルと80のヨーグルトなしサンプル（合計=320）となります。

コンプライアンスと予想される脱落：毎日の食品消費を追跡するためのチェックリストが提供されます。 CRCの監督下でINAFで3回の完全な食事を摂取することで、プロトコルへの順守が強化されます。 我々の以前の同様のデザインの研究では、提供された食品の99%が消費され[28, 29]、逸脱はすべて自己申告による逸話的なもののみでした。 Drouin-Chartier教授は当初、50名のヘテロ接合性家族性高コレステロール血症成人を対象としたCIHR資金による完全給食RCT内で、同じ7日間メニューを開発し使用しました。介入は4週間持続しました。 コンプライアンスは>99%で、食事は高く評価され、女性と男性参加者の間に差はありませんでした。 我々は以前に、より長期間（例：5×4週間または3×6週間）の完全管理給食RCTを、より侵襲的な手順（例：腸生検）とカナダの習慣にあまり典型的でない食事（例：地中海式、乳製品を含まない）で実施しましたが、脱落率は20%を超えることはありませんでした[28, 29, 41]。 ウォッシュアウト期間は脱落リスクを低減します。 我々はコンプライアンスの問題はないと予想します。 我々は20名の参加者を登録する計画で、少なくとも16名が完全なプロトコルを完了すると予想しています。

募集手順： 包含基準： 年齢：18-70歳； BMI：18-40 kg/m²； プレーンヨーグルトを毎日3週間摂取する意思； コーヒー/紅茶消費者については、これらをミルク、クリーム、砂糖を加えずに4週間摂取する意思。 除外基準： 乳糖不耐症； 2か月以内の献血； 重度の慢性疾患または感染症、自己免疫疾患、がん、2型糖尿病、クローン病、セリアック病、肝臓または腎臓疾患などの治療中； 重度のがん、心血管疾患または肥満外科手術の病歴； 3か月間の不安定な体重； 違法薬物使用またはアルコール依存症； タバコ/大麻喫煙/ベイピング（毎日の変動がないことと消費の客観的報告は複雑すぎるため）； 食事の成分に対するアレルギーまたは嫌悪。 参加者は、ケベックシティ地域から、INAF（リーチ：>5,000）およびラバル大学（>20,000）からの一斉メールを通じて募集されます。 興味のある個人は、スクリーニング電話のためにCRCに連絡するよう招待されます。 適格な個人はその後、対面情報セッションに招待され、プロトコルの完全な詳細が説明されます。 興味のある者はインフォームドコンセントを提供するよう求められます。 その後、参加者は無作為化され、ベースライン訪問がスケジュールされます。 合計10の異なる無作為化順序がウィリアムズデザインを使用して生成され、各処置が他のすべての処置に等しい回数続くことを保証します。 各順序は、性別特異的な方法で単一の参加者に割り当てられます。 我々は、試験の完了に20週間を要すると予想します。 INAFはカナダ最大の臨床栄養研究ユニット（800 m²）を擁し、完全管理RCTを実施できる国内でも数少ない施設の一つです。 代謝キッチン、カフェテリア、生物学的検体採取スペース、食事評価、参加者無作為化と管理のためのeプラットフォーム、メタボロミクスプラットフォームを備えています。 常勤の研究看護師が在籍しています。 ULavalのデータセンターは安全な保管と分析能力を保証します。 この最先端のインフラストラクチャーがプロジェクトの成功の鍵です。

メタボロミクスプロファイリング： 試験完了後、血漿サンプルはINAFメタボロミクスプラットフォームで、4つの相補的LC法（陽性および陰性エレクトロスプレーイオン化）を使用して処理され、約22,000の代謝物の相対存在量が決定されます。 これらには、アミノ酸、糖、および低分子有機酸（BEHアミド）；ポリフェノール代謝物および低分子ペプチド（HSS T3）；遊離脂肪酸および胆汁酸（CSH C18）；および脂質（BEH C8）が含まれます。 血漿サンプルに加えて、4種類のヨーグルト各々と大豆プリンのサンプルも処理します。 メタボロミクスプロファイリングは、Thermo Vanquish U-HPLCをThermo Fusion Tribrid Orbitrap質量分析計に結合したもの、または方法に応じてWaters Acquity I-Class UPLCをWaters Synapt G2-Siに結合したものを使用して実施されます。 生データはCompound DiscovererおよびProgenesis QIを使用して処理されます。 代謝物同定は、成長し続けるINAF分析標準バンク（n=1,000化合物、例：アミノ酸、腸由来代謝物、胆汁酸、フェノール化合物、脂肪酸）を使用して実行されます。 関心のある追加のクロマトグラフィーピークは、複数のスペクトルおよび分子データベース（例：mzCloud、HMDB）を使用して仮同定されます。 メタボロミクスプロファイリングは1か月を要すると予想されます。

統計分析： ステップ1：ヨーグルト摂取の潜在的なバイオマーカーの同定。 これを行うために、我々はヨーグルト含有食事とヨーグルトを含まない食事を区別することを可能にするすべての代謝物を同定することを目指します。 独立変数には、現在の試験の各参加者からの血漿サンプル（320観測、うち80はヨーグルトなし）と、我々の以前の牛乳およびチーズバイオマーカー研究（n=284ヨーグルトなし血漿サンプル、同じメタボロミクス法で処理；合計=604）を考慮して、4つの介入各々の後に測定されたすべての代謝物（n=22,000）の相対存在量を含みます。 従属変数は「食事中のヨーグルトの存在」（はい/いいえ）です。 我々は分類モデルを訓練するために極限勾配ブースティングアルゴリズム（XGBoost）を使用します[42]。 反復プロセスがn回繰り返されます：（1）モデルの訓練、（2）順列検定によって計算された最高の予測能力を持つ代謝物の同定、（3）次の反復前にこの代謝物の除去。 各反復について、参加者を訓練（80%；n=484観測）とテスト（20%；n=120）セットに異なる分割を使用して25モデルが訓練されます。 反復は、モデルの感度または特異度95%信頼区間が0.5（分類アルゴリズムの無効予測力）に達するまで続けられます。 このステップの終わりに、除去されたn個の代謝物がヨーグルト摂取の潜在的なバイオマーカーのプールを構成し、後のステップのために保持されます。 後のステップは、FoodBALLによって提案された、検証済み食物摂取バイオマーカーの主要特性をテストするための標準的統計アプローチを活用します。 特に指定がない限り、以下のすべてのテストは、従属変数として代謝物相対存在量を持つ、反復測定のための混合モデルを使用して実施されます。 モデルは年齢、性別、体格指数、および食事からの総1日カロリーで調整されます。

ステップ2、粗用量応答性： 我々は、ヨーグルトを含まない食事とヨーグルト含有食事後の各潜在バイオマーカーの相対存在量を比較します。 ヨーグルト消費とともに存在量が増加する代謝物のみが次のステップに進みます。

ステップ3、精製用量応答性： 我々は、研究で試験された3つのヨーグルト摂取レベル全体での代謝物の相対存在量を比較します。 ヨーグルトを含まない食事を0としてコード化した場合に有意な線形傾向を示す代謝物が保持されます。

ステップ4、時間応答性： 急性試験食中に採取された血漿サンプルからのデータを使用して、代謝物の相対存在量が時間とともに増加するかどうかを評価します。 ヨーグルト摂取後に対照の大豆ベースのプリンと比較して曲線下面積（AUC）が大きい代謝物が保持されます。

ステップ5、特異性： ヨーグルトに対する特異性を確認するために、代謝物はヨーグルトでは存在量が増加するが、牛乳またはチーズでは増加しないことを示さなければなりません。 これをテストするために、我々はDrouin-Chartier教授が保持する以前のDFC助成金から生成されたメタボロミクスデータを使用します。 この以前のプロジェクトでは、牛乳またはチーズ摂取が4〜6週間にわたる心血管代謝リスク因子に及ぼす影響を評価することを目的とした、完全給食設定の4つの以前に実施されたクロスオーバーRCTから採取された血漿サンプルを使用して、牛乳およびチーズ摂取の代謝物バイオマーカーを別々に同定しました。 このデータセットは、118名の個人からの完全管理牛乳またはチーズ含有食事および乳製品を含まない食事のメタボロミクスデータを含みます。 牛乳またはチーズによって存在量が増加しない代謝物がこのステップの終わりに保持されます。 これは追加コストなしで実施されます。

ステップ6、頑健性： 我々はまた、我々の過去のDFC助成金で生成されたメタボロミクスデータを使用します。 これらは、絶食血漿サンプルを提供し、血漿サンプリング前の週に3回の24時間食事思い出し法（R24W）を完了した200名の成人の横断コホートから得られます。そのうち1回は血漿サンプリング前日の食事摂取を報告します。 参加者はヨーグルト摂取量の中央値で分割されます。 中央値以上の参加者でより高い存在量を持つ代謝物のみが保持されます。 このステップも追加コストは発生しません。

ステップ7、妥当性： 我々は、保持された代謝物がヨーグルトに由来する可能性について、その性質と化学構造に基づいて、牛乳組成データベースを使用して評価します。 さらに、これらの代謝物を4つの試験されたヨーグルトのメタボロミクスプロファイルと比較します。 このステップの後、保持された代謝物は、検証済みヨーグルト摂取バイオマーカーと見なされるためのFoodBALLの必須基準をすでに満たしていることになります。 ヨーグルトのユニークなマトリックス特性を考慮して、我々はすべての基準を満たす少なくとも1つの代謝物を同定できると確信しています。 我々の以前の研究では、我々は牛乳摂取のための1つのバイオマーカー（牛乳特異的成分であるデルタバレロベタイン）とチーズ摂取のための9つの異なる他のバイオマーカーを正常に同定しました。

パフォーマンス評価： 我々はまず、同定されたバイオマーカーを使用してヨーグルト摂取を推定するモデルを訓練し、その相対存在量を試験中に参加者に提供された既知のヨーグルト摂取レベルと照合します。 これは、バイオマーカーに基づいて食物摂取をモデル化するために特に開発されたMultimarkerアルゴリズム[43, 44]を使用して行われます。 モデルは校正方程式を生成し、我々はこれを使用して24時間食事思い出し法データを校正し、バイオマーカー校正済みヨーグルト摂取推定値を生成します。 次に、ヨーグルト摂取推定値の精度を、以下を使用して得られたものについて評価します： a) 校正方程式（バイオマーカーのみ）、 b) 校正済み24時間食事思い出し法（バイオマーカー×自己申告摂取）、 c) 未校正24時間食事思い出し法（自己申告摂取のみ）、各々を研究メニューで提供された真の摂取量と比較します。 我々は、ピアソン相関係数とその95%信頼区間を方法間でt検定を使用して比較します。