Identifiering av objektiva metabolomiska biomarkörer för yoghurtkonsumtion (YOGBIO)

Den amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten (FDA) bedömde nyligen att de vetenskapliga bevisen var tillräckligt robusta för att godkänna en ansökan om en kvalificerad hälsoanspråk för yoghurt och minskad risk för typ 2-diabetes (T2D). Däremot har Health Canada ännu inte godkänt ett liknande anspråk. De befintliga bevisen härrör uteslutande från prospektiva kohortstudier som förlitar sig på självrapporterade kostfrågeformulär, vilka – trots att de är validerade – är föremål för slumpmässiga och systematiska fel som kan äventyra beviskvaliteten och hindra regleringsgodkännande.

Biomarkörer för matintag erkänns alltmer som värdefulla verktyg för att öka objektiviteten inom nutritionsepidemiologi. Metabolomik, den omfattande profileringen av plasmametaboliter, anses vara guldstandarden för att identifiera sådana biomarkörer. Inom mejerikontexten var en stor milstolpe identifieringen av ett metabolomiskt signatur för yoghurtintag i en stor spansk kohort. Denna signatur – bestående av 27 metaboliter (t.ex. C14:0 sfingomyelin, härlett från myristinsyra) – var prediktiv för yoghurtintag i en oberoende amerikansk kohort och associerad med lägre T2D-incidens i båda populationerna. Men eftersom denna signatur härrörde från observationsdata saknade den specifitet för yoghurtintag.

Detta projekt syftar till att fylla detta kritiska gap genom att upptäcka specifika biomarkörer för yoghurtintag och validera dem mot erkända kriterier.

Vi kommer att genomföra en randomiserad, crossover, dos-respons foderförsöksstudie med 16 generellt friska vuxna (8 kvinnor, 8 män). Studien kommer att bestå av 4 förutbestämda dieter, var och en på 7 dagar och separerade med en 1-veckas utspolningsperiod. På den 7:e dagen av varje diet kommer deltagarna att genomgå ett blandad-måltidstest vid INAF för att samla plasmaprov i postprandiellt tillstånd. De 4 dieterna kommer att baseras på en mejerifri bakgrundsdiet som reflekterar hög följsamhet till Kanadas kostråd, med följande tillägg:

1. 125 g per 2 380 kcal per dag av en sojabaserad pudding (dvs. yoghurtfri diet);
2. 90 g per 2 380 kcal per dag av yoghurt (dvs. 0,5 referensportion yoghurt per 2 380 kcal per dag);
3. 175 g per 2 380 kcal per dag av yoghurt (dvs. 1 referensportion yoghurt per 2 380 kcal per dag);
4. 350 g per 2 380 kcal per dag av yoghurt (dvs. 2 referensportioner per 2 380 kcal per dag).

För att säkerställa att de identifierade biomarkörerna reflekterar yoghurtens mångfald kommer fyra yoghurtvarianter att testas:

a) fettfri vanlig naturell yoghurt; b) 2% mjölkfett vanlig naturell yoghurt; c) fettfri grekisk naturell yoghurt; d) 2% mjölkfett grekisk naturell yoghurt. Varje yoghurttyp kommer att tilldelas fyra deltagare, som kommer att konsumera samma typ konsekvent under hela studien. Målet är inte att identifiera en distinkt biomarkör för varje yoghurttyp utan att säkerställa att den/de identifierade biomarkörerna tar hänsyn till yoghurttypernas mångfald. För den yoghurtfria interventionen kommer alla deltagare att konsumera samma sojabaserade pudding. Deltagarna kommer att genomföra de fyra 7-dagarsinterventionerna i slumpmässig ordning. Denna design säkerställer att eventuella observerade variationer i plasmametabolomet endast kan tillskrivas yoghurt.

Under alla fyra interventionerna kommer alla måltider och livsmedel att tillhandahållas med en 7-dagars cyklisk meny, som tidigare gjorts av vårt team [28-30]. Bakgrundsdieten för varje intervention kommer att vara identisk, mejerifri (dvs. exklusive alla mejeriprodukter och smör) och utformad för att reflektera hög följsamhet till Kanadas kostråd, med tonvikt på minimalt processade växtbaserade livsmedel. För att öka acceptansen och följsamheten kommer menyn att innehålla minst ett recept från den officiella Kanadas kostrådsdokumentation varje dag [31, 32]. En erfaren livsmedelstekniker kommer att förbereda dieterna, med alla livsmedel och ingredienser exakt vägda till närmaste 0,1 g. I kontexten av intagsbiomarköridentifiering ansågs naturell yoghurt vara det mest lämpliga valet istället för smaksatt yoghurt. Emellertid är naturell yoghurt mindre smakrik på grund av sin sura smak. För att hantera detta kommer bakgrundsdieten att innehålla en daglig portion småfrukter som deltagarna kommer att instrueras att antingen blanda i yoghurten (eller sojapuddingen) eller konsumera tillsammans med. Eftersom fruktportionen kommer att vara standardiserad och konsumeras i konsekventa mängder varje dag över de fyra interventionerna kommer den inte att introducera förväxling i yoghurtbiomarköridentifieringsprocessen. Vi anser att detta tillvägagångssätt också är gynnsamt för att säkerställa följsamhet under dieten som innehåller sojabaserad pudding.

Över de fyra yoghurttyperna och tre intagsnivåerna kommer yoghurt att bidra med i genomsnitt 120 kcal/dag, liksom kontrollsojapuddingen. Det lägsta kaloribidraget kommer att vara 40 kcal (fettfri vanlig naturell yoghurt, 90 g/dag), och det högsta kommer att vara 240 kcal (2% mjölkfett grekisk naturell yoghurt; 350 g/dag). Dessa kalorier kommer att läggas till en 2 380 kcal/dag bakgrundsdiet för att skapa en standardiserad meny som i genomsnitt kommer att uppgå till 2 500 kcal/dag över de fyra interventionerna. Med tanke på att interventionerna endast varar i sju dagar är det osannolikt att skillnaden i kaloribidraget från yoghurterna eller sojapuddingen kommer att påverka kroppsvikten eller introducera förväxling. Det föreslagna tillvägagångssättet – att lägga till de testade livsmedlen till en identisk isoenergetisk bakgrundsdiet – är den optimala strategin. För en enskild deltagare kommer den enda skillnaden mellan de fyra dieterna att vara yoghurthalten, vilket säkerställer att eventuella post-dietskillnader i plasmametabolomet endast kan tillskrivas yoghurt. Omvänt, om vi valde att upprätthålla en liknande total kaloriinnehåll i bakgrundsdieten över de fyra faserna, skulle ändringar av bakgrundsdieten krävas, vilket skulle introducera bias i plasmametabolomet. Vid baslinje kommer deltagarnas energibehov att uppskattas med validerade prediktiva ekvationer [33], och dieternas totala energiinnehåll kommer att justeras därefter för att möta dessa behov.

Under var och en av de fyra 7-dagarsinterventionerna kommer deltagarna att krävas att konsumera minst tre fullständiga måltider vid INAF under klinisk forskningskoordinatorns (CRC) övervakning. Under dessa besök kommer de också att få sina måltider för de kommande 24 till 72 timmarna. Deltagarna kommer att instrueras att endast konsumera de tillhandahållna livsmedlen och att konsumera alla måltider som levererats. Alkohol, vitamintillskott och naturliga hälsoprodukter kommer inte att tillåtas. Te och kaffe (≤2 koppar/dag) kommer att tillåtas, utan dagliga fluktuationer och utan mjölk, grädde eller socker. Obegränsad mängd vatten kommer att tillåtas. Deltagarna kommer att instrueras att upprätthålla sin vanliga fysiska aktivitetsnivå stabil under hela protokollet. På den 7:e dagen av varje diet kommer deltagarna att genomgå ett akut blandad-måltidstest för att informera om tidsresponsiviteten hos yoghurtbiomarkörerna. Efter en 12-timmars fasta kommer deltagarna att anlända till INAF kl. 07:30. Testmåltiden kommer att bestå av en frukostsmoothie som innehåller samma yoghurt (eller sojabaserad pudding) som tillhandahållits dagligen under de föregående dagarna. Plasmaprov kommer att samlas vid baslinje (fasta) och 1, 2, 4 och 6 timmar efter måltiden. Proverna kommer att dras i EDTA-rör och lagras vid -80°C.

Under testet kommer deltagarna att instrueras att fylla i ett validerat självadministrerat webbaserat 24-timmars kostrecall (R24W), specifikt validerat för forskning bland vuxna i Quebec [34-40]. Den fullständiga metodologin och valideringen bakom R24W är publicerad [34-40]. Kortfattat guidar R24W deltagarna att ange alla livsmedel och drycker, inklusive alkohol, som konsumerats under föregående dag. R24W tillåter att välja livsmedel och drycker som konsumerats genom att bläddra i en strukturerad lista över livsmedel eller genom att använda en sökmotor. Den innehåller också standardiserade bilder för att hjälpa till att bedöma portionsstorlekar. Dessa data kommer att användas för att jämföra prestandan hos R24W med yoghurtbiomarkörerna i att uppskatta den sanna yoghurthalten i dieten.

Deltagare och CRC kan inte bli blindade för dietallokering. Emellertid kommer den exakta mängden yoghurt (eller sojabaserad pudding) i dieterna inte att avslöjas för deltagarna. De fyra dieterna kommer att slumpmässigt märkas med bokstäver (t.ex. A=mycket yoghurt, B=soja, C=lite yoghurt, D=måttlig yoghurt). Detta tillvägagångssätt kommer att minimera informationsbias för utförandet av R24W i slutet av varje intervention. Varje intervention kommer att separeras med en 1-veckas utspolningsperiod, för att ge deltagarna en paus, vilket minskar risken för avhopp associerade med en flerveckorsintervention. Under utspolningen kommer deltagarna att instrueras att återgå till sin vanliga diet. Vi förväntar oss inga carryover-effekter av dieten under utspolningen på de efterföljande 7-dagarsinterventionsperioderna med avseende på yoghurtintagsbiomarköridentifiering. Identifieringen av yoghurtintagsbiomarkör kommer faktiskt att utnyttja plasmaproven som samlats på dag sju av varje intervention, både i fasta och postprandiella tillstånd. Således är det mycket osannolikt att en biomarkör från livsmedel som konsumerats under utspolningsperioden uppvisar den akuta postprandiella responsiviteten som förväntas för yoghurtintagsbiomarkör under den föreslagna designen [27]. Total deltagartid i studien kommer att vara 7 veckor. I slutet av studien kommer vi för varje deltagare ha totalt 15 plasmaprov samlade efter yoghurtkonsumtion (dvs. 5 prover x 3 nivåer av yoghurtintag) och 5 prover samlade efter den yoghurtfria dieten, för totalt 240 post-yoghurtprover och 80 utan yoghurt (total=320).

Följsamhet och förväntade avhopp: En checklista kommer att tillhandahållas för att spåra daglig livsmedelskonsumtion. Att ha 3 fullständiga måltider konsumerade vid INAF under CRC:s övervakning kommer att stärka följsamheten till protokollet. I våra tidigare studier med liknande design konsumerades 99% av de tillhandahållna livsmedlen [28, 29], med endast anekdotiska avvikelser, alla självrapporterade. Prof. Drouin-Chartier utvecklade ursprungligen och använde samma 7-dagarsmeny inom ett CIHR-finansierat fullt utfodrat RCT med 50 vuxna med heterozygot familjär hyperkolesterolemi, med interventioner på 4 veckor. Följsamheten var >99% och dieten var mycket uppskattad, utan skillnader mellan kvinnliga och manliga deltagare. Vi har tidigare genomfört helt kontrollerade utfodrings-RCT:er av längre varaktighet (t.ex. 5×4 veckor eller 3×6 veckor) med mer invasiva procedurer (t.ex. tarmbiopsier) och dieter mindre typiska för kanadensiska vanor (t.ex. mediterran, mejerifri), ändå översteg avhoppsfrekvenserna aldrig 20% [28, 29, 41]. Utspolningsperioderna minskar avhoppsrisk. Vi förväntar oss inga följsamhetsproblem. Vi planerade att rekrytera 20 deltagare, förväntande att minst 16 skulle slutföra hela protokollet.

Rekryteringsprocedurer: Inklusionskriterier: ålder: 18-70 år; BMI: 18-40 kg/m²; vilja att konsumera naturell yoghurt dagligen i 3 veckor; för kaffe/te-konsumenter, vilja att konsumera dessa drycker utan tillsatt mjölk, grädde eller socker i 4 veckor. Exklusionskriterier: laktosintolerans; blodgivning inom 2 månader; allvarlig kronisk sjukdom eller pågående behandling för tillstånd som infektioner, autoimmuna sjukdomar, cancer, typ 2-diabetes, Crohns sjukdom, celiaki, leversjukdomar eller njursjukdomar; historia av allvarlig cancer, hjärt-kärlsjukdom eller bariatrisk kirurgi; instabil kroppsvikt i 3 månader; illegalt drogbruk eller alkoholism; tobak/cannabisrökning/vaping (att säkerställa inga dag-till-dag-fluktuationer och objektiv rapportering av konsumtion är för komplex); allergier eller aversjoner mot komponenter i dieterna. Deltagare kommer att rekryteras från Quebec City-området genom massutskick från INAF (räckvidd: >5 000) och Université Laval (>20 000). Intresserade individer kommer att bjudas in att kontakta CRC för ett screeningsamtal. Berättigade individer kommer sedan att bjudas in till en personlig informationssession, där hela protokolldetaljerna kommer att förklaras. De intresserade kommer att ombedjas att ge informerat samtycke. Därefter kommer deltagarna att randomiseras, och ett baslinjebesök kommer att schemaläggas. Totalt 10 olika randomiseringssekvenser kommer att genereras med Williams design för att säkerställa att varje behandling följer varje annan behandling ett lika antal gånger. Varje sekvens kommer att tilldelas en enskild deltagare, på ett könspecifikt sätt. Vi förväntar oss att studien kommer att kräva 20 veckor att slutföra. INAF är hem till Kanadas största kliniska nutritionsforskningsenhet (800 m²), och en av de få anläggningarna i landet kapabel till helt kontrollerade RCT:er. Den har ett metabolt kök, cafeteria, utrymmen för biologiskt provinsamling, en e-plattform för kostbedömning, deltagarrandomisering och hantering, och en metabolomikplattform. En heltids forskningssjuksköterska finns på personalen. ULavals datacenter säkerställer säker lagring och analytisk kapacitet. Denna state-of-the-art infrastruktur är nyckeln till projektets framgång.

Metabolomikprofilering: När studien är slutförd kommer plasmaproven att bearbetas på INAF:s metabolomikplattform med fyra kompletterande LC-metoder (positiv och negativ elektrosprayjonisering) för att bestämma den relativa abundansen av ~22 000 metaboliter. Dessa inkluderar aminosyror, sockerarter och små organiska syror (BEH Amide); polyphenolmetaboliter och små peptider (HSS T3); fria fettsyror och gallsyror (CSH C18); och lipider (BEH C8). Utöver plasmaproven kommer vi också att bearbeta prover av var och en av de 4 yoghurterna och sojapuddingen. Metabolomikprofilering kommer att genomföras med en Thermo Vanquish U-HPLC kopplad till en Thermo Fusion Tribrid Orbitrap masspektrometer eller en Waters Acquity I-Class UPLC kopplad till en Waters Synapt G2-Si, beroende på metod. Rådata kommer att bearbetas med Compound Discoverer och Progenesis QI. Metabolitidentifiering kommer att utföras med den ständigt växande INAF-analysstandardbanken (n=1 000 föreningar, t.ex. aminosyror, tarmhärledda metaboliter, gallsyror, fenoliska föreningar, fettsyror). Ytterligare kromatografiska toppar av intresse kommer att genomgå preliminär identifiering med flera spektrala och molekylära databaser (t.ex. mzCloud, HMDB). Metabolomikprofilering förväntas ta 1 månad.

Statistiska analyser: Steg 1: identifiering av potentiella biomarkörer för yoghurtintag. För att göra detta syftar vi till att identifiera alla metaboliter som tillåter att skilja mellan en yoghurtinnehållande och en yoghurtfri diet. Oberoende variabler kommer att inkludera den relativa abundansen av alla metaboliter (n=22 000) mätta efter var och en av de fyra interventionerna, med hänsyn till plasmaprover för varje deltagare från denna studie (320 observationer, varav 80 är yoghurtfria), och från vår tidigare mjölk- och ostbiomarkörstudie (n=284 yoghurtfria plasmaprover, bearbetade med samma metabolomikmetoder; totalt=604). Den beroende variabeln kommer att vara "närvaro av yoghurt i dieten" (ja/nej). Vi kommer att använda extreme gradient boosting-algoritmen (XGBoost) för att träna klassificeringsmodeller [42]. En iterativ process kommer att upprepas n gånger: (1) träna modellerna, (2) identifiera metaboliten med bäst prediktiv förmåga, beräknad genom permutationsprovning, och (3) ta bort denna metabolit före nästa iteration. För varje iteration kommer 25 modeller att tränas med olika uppdelningar av deltagare i tränings- (80%; n=484 observationer) och test- (20%; n=120) set. Iterationerna kommer att fortsätta tills känslighets- eller specificitets 95% konfidensintervall för modellerna når 0,5 (null prediktiv kraft för en klassificeringsalgoritm). I slutet av detta steg kommer de n borttagna metaboliter att utgöra poolen av potentiella biomarkörer för yoghurtintag, som kommer att behållas för efterföljande steg. De efterföljande stegen kommer att utnyttja standard statistiska tillvägagångssätt för att testa nyckelegenskaperna hos en validerad biomarkör för matintag, som föreslagits av FoodBALL. Om inte annat anges kommer alla följande tester att genomföras med blandade modeller för upprepade mätningar, med metabolitrelativ abundans som den beroende variabeln. Modellerna kommer att justeras för ålder, kön, kroppsmassaindex och totala dagliga kalorier från dieten.

Steg 2, grov dos-responsivitet: Vi kommer att jämföra den relativa abundansen för varje potentiell biomarkör efter yoghurtfria och yoghurtinnehållande dieter. Endast metaboliter vars abundans ökar med yoghurtkonsumtion kommer att gå vidare till nästa steg.

Steg 3, förfinad dos-responsivitet: Vi kommer att jämföra den relativa abundansen av metaboliter över de tre testade yoghurtintagsnivåerna i studien. Metaboliter som visar en signifikant linjär trend, med den yoghurtfria dieten kodad som 0, kommer att behållas.

Steg 4, tidsresponsivitet: Med data från plasmaprover samlade under det akuta testmåltidet kommer vi att bedöma om den relativa abundansen av metaboliter ökar över tid. Metaboliter med ett större area under kurvan (AUC) efter yoghurtintag jämfört med sojapuddingen kommer att behållas.

Steg 5, specificitet: För att bekräfta specificitet för yoghurt måste metaboliter visa ökad abundans med yoghurt men inte med mjölk eller ost. För att testa detta kommer vi att använda metabolomikdata genererade från det tidigare DFC-bidraget som prof. Drouin-Chartier innehaft. I detta tidigare projekt användes plasmaprover samlade från 4 tidigare genomförda crossover-RCT:er med helt utfodrade miljöer som syftade till att utvärdera effekten av mjölk- eller ostintag över 4 till 6 veckor på kardiometabola riskfaktorer för att identifiera metabolitbiomarkörer för mjölk- och ostintag, separat. Denna dataset innehåller metabolomikdata från helt kontrollerade mjölk- eller ostinnehållande dieter och en mejerifri diet för 118 individer. Metaboliter vars abundans inte ökas av mjölk eller ost kommer att behållas i slutet av detta steg. Detta kommer att genomföras utan extra kostnad.

Steg 6, robusthet: Vi kommer också att använda metabolomikdata genererade i vårt tidigare DFC-bidrag. Dessa kommer från en tvärsnittskohort av 200 vuxna som gav ett fastande plasmaprov och slutförde tre 24-timmars kostrecall (R24W) i veckan före provtagning, inklusive en som rapporterade om sina kostintag dagen före provtagning. Deltagarna kommer att delas efter median yoghurtintag. Endast metaboliter med större abundans hos deltagare över medianen kommer att behållas. Detta steg kommer också att medföra ingen extra kostnad.

Steg 7, plausibilitet: Vi kommer att bedöma plausibiliteten för de behållna metaboliter som härrör från yoghurt baserat på deras natur och kemiska strukturer, med hjälp av Milk Composition Database. Dessutom kommer vi att jämföra dessa metaboliter med metabolomikprofilerna för de fyra testade yoghurterna. Efter detta steg kommer de behållna metaboliter redan att ha uppfyllt FoodBALL:s väsentliga kriterier för att anses validerade biomarkörer för yoghurtintag. Med tanke på yoghurtens unika matrisegenskaper är vi säkra på att identifiera minst en metabolit som uppfyller alla kriterier. I vårt tidigare arbete identifierade vi framgångsrikt en biomarkör för mjölkintag (delta-valerobetain, en mjölkspecifik komponent) och nio andra för ostintag.

Prestandautvärdering: Vi kommer först att träna en modell för att uppskatta yoghurtintag med de identifierade biomarkörerna genom att korsreferera deras relativa abundans med de kända yoghurtintagsnivåerna som tillhandahållits till deltagarna under studien. Detta kommer att göras med Multimarker-algoritmen [43], som specifikt utvecklats för att modellera matintag baserat på biomarkörer [44]. Modellen kommer att generera en kalibreringsekvation som vi kommer att använda för att kalibrera 24-timmars kostrecall-data och producera biomarkörkalibrerade uppskattningar av yoghurtintag. Därefter kommer vi att utvärdera noggrannheten hos yoghurtintagsuppskattningar som erhållits med: a) kalibreringsekvationen (enbart biomarkörer), b) den kalibrerade 24-timmars kostrecallen (biomarkörer × självrapporterat intag), och c) den okalibrerade 24-timmars kostrecallen (enbart självrapporterat intag), genom att jämföra var och en med det sanna intaget som tillhandahållits i studiemenyer. Vi kommer att jämföra Pearsons korrelationskoefficienter och deras 95% konfidensintervall över metoder med t-tester.