Идентификация объективных биомаркеров потребления йогурта на основе метаболомики (YOGBIO)

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США недавно признало научные доказательства достаточно убедительными для одобрения петиции о квалифицированном заявлении о пользе йогурта для здоровья в связи со снижением риска развития диабета 2 типа (СД2). В отличие от этого, Министерство здравоохранения Канады еще не одобрило аналогичное заявление. Существующие доказательства получены исключительно из проспективных когортных исследований, основанных на самоотчетных диетических опросниках, которые, несмотря на их валидацию, подвержены случайным и систематическим ошибкам, что может снизить качество доказательств и затруднить получение регуляторного одобрения.

Биомаркеры потребления пищи все чаще признаются ценными инструментами для повышения объективности в нутрициологической эпидемиологии. Метаболомика, комплексное профилирование метаболитов плазмы, считается золотым стандартом для идентификации таких биомаркеров. В контексте молочных продуктов важной вехой стала идентификация метаболомной сигнатуры потребления йогурта в крупной испанской когорте. Эта сигнатура, включающая 27 метаболитов (например, C14:0 сфингомиелин, производное миристиновой кислоты), позволяла прогнозировать потребление йогурта в независимой американской когорте и была связана с более низкой заболеваемостью СД2 в обеих популяциях. Однако, поскольку эта сигнатура была получена из наблюдательных данных, ей не хватало специфичности в отношении потребления йогурта.

Данный проект направлен на восполнение этого критического пробела путем обнаружения специфических биомаркеров потребления йогурта и их валидации в соответствии с признанными критериями.

Мы проведем рандомизированное перекрестное исследование с дозозависимым питанием с участием 16 в целом здоровых взрослых (8 женщин, 8 мужчин). Исследование будет состоять из 4 предопределенных диет, каждая продолжительностью 7 дней и разделенных 1-недельным периодом вымывания. На 7-й день каждой диеты участники пройдут тест со смешанным приемом пищи в INAF для сбора образцов плазмы в постпрандиальном состоянии. 4 диеты будут основаны на фоновой диете, не содержащей молочных продуктов, отражающей высокое соответствие канадскому руководству по питанию, со следующими добавками:

1. 125 г на 2 380 ккал в день соевого пудинга (т.е. диета без йогурта);
2. 90 г на 2 380 ккал в день йогурта (т.е. 0,5 эталонной порции йогурта на 2 380 ккал в день);
3. 175 г на 2 380 ккал в день йогурта (т.е. 1 эталонная порция йогурта на 2 380 ккал в день);
4. 350 г на 2 380 ккал в день йогурта (т.е. 2 эталонные порции на 2 380 ккал в день).

Чтобы обеспечить, что идентифицированные биомаркеры отражают разнообразие йогуртов, будут протестированы четыре разновидности йогурта:

a) обезжиренный натуральный обычный йогурт; b) натуральный обычный йогурт с 2% молочного жира; c) обезжиренный натуральный греческий йогурт; d) натуральный греческий йогурт с 2% молочного жира. Каждый тип йогурта будет назначен четырем участникам, которые будут потреблять один и тот же тип на протяжении всего исследования. Цель состоит не в том, чтобы идентифицировать отдельный биомаркер для каждого типа йогурта, а в том, чтобы обеспечить учет разнообразия типов йогурта идентифицированным(и) биомаркером(ами). Для вмешательства без йогурта все участники будут потреблять один и тот же соевый пудинг. Участники пройдут четыре 7-дневных вмешательства в случайном порядке. Такая конструкция гарантирует, что любые наблюдаемые вариации в плазменном метаболоме будут обусловлены исключительно йогуртом.

Во время всех четырех вмешательств все приемы пищи и продукты будут предоставляться с использованием 7-дневного циклического меню, как это делалось ранее нашей командой [28-30]. Фоновая диета для каждого вмешательства будет идентичной, не содержащей молочных продуктов (т.е. исключая все молочные продукты и сливочное масло) и разработанной для отражения высокого соответствия канадскому руководству по питанию, с акцентом на минимально обработанные растительные продукты. Для повышения приемлемости и соблюдения диеты меню будет включать как минимум один рецепт из официальной документации канадского руководства по питанию каждый день [31, 32]. Опытный технолог по пищевым продуктам будет готовить диеты, при этом все продукты и ингредиенты будут точно взвешены с точностью до 0,1 г. В контексте идентификации биомаркеров потребления натуральный йогурт был признан наиболее подходящим выбором вместо ароматизированного йогурта. Однако натуральный йогурт менее вкусен из-за кислого вкуса. Чтобы решить эту проблему, фоновая диета будет включать ежедневную порцию мелких фруктов, которые участникам будет предложено либо смешивать с йогуртом (или соевым пудингом), либо употреблять отдельно. Поскольку порция фруктов будет стандартизирована и потребляться в постоянном количестве каждый день во всех четырех вмешательствах, это не внесет искажений в процесс идентификации биомаркеров йогурта. Мы считаем этот подход также благоприятным для обеспечения соблюдения диеты, содержащей соевый пудинг.

Среди четырех типов йогурта и трех уровней потребления йогурт будет вносить в среднем 120 ккал/день, как и контрольный соевый пудинг. Наименьший калорийный вклад составит 40 ккал (обезжиренный натуральный обычный йогурт, 90 г/день), а наибольший — 240 ккал (натуральный греческий йогурт с 2% молочного жира; 350 г/день). Эти калории будут добавлены к фоновой диете в 2 380 ккал/день для создания стандартизированного меню, которое в среднем составит 2 500 ккал/день по четырем вмешательствам. Учитывая, что вмешательства длятся всего семь дней, маловероятно, что разница в калорийности йогуртов или соевого пудинга повлияет на массу тела или внесет искажения. Предлагаемый подход — добавление тестируемых продуктов к идентичной изоэнергетической фоновой диете — является оптимальной стратегией. Для одного участника единственным различием между четырьмя диетами будет содержание йогурта, что гарантирует, что любые различия в плазменном метаболоме после диеты будут обусловлены исключительно йогуртом. Напротив, если бы мы решили поддерживать аналогичное общее калорийное содержание фоновой диеты на всех четырех фазах, потребовались бы изменения фоновой диеты, что внесло бы смещение в плазменный метаболом. На исходном уровне потребности участников в энергии будут оценены с использованием валидированных прогностических уравнений [33], и общая энергетическая ценность диет будет соответственно скорректирована для удовлетворения этих потребностей.

Во время каждого из четырех 7-дневных вмешательств участники должны будут потреблять как минимум три полноценных приема пищи в INAF под наблюдением координатора клинических исследований (ККИ). Во время этих визитов они также будут получать свои приемы пищи на следующие 24–72 часа. Участникам будет дано указание потреблять только предоставленные продукты и употреблять все блюда в том виде, в каком они предоставлены. Алкоголь, витаминные добавки и натуральные продукты для здоровья не будут разрешены. Чай и кофе (≤2 чашки/день) будут разрешены, без ежедневных колебаний и без молока, сливок или сахара. Неограниченное количество воды будет разрешено. Участникам будет дано указание поддерживать свой обычный уровень физической активности стабильным на протяжении всего протокола. На 7-й день каждой диеты участники пройдут острый тест со смешанным приемом пищи для получения информации о временной отзывчивости биомаркеров йогурта. После 12-часового голодания участники прибудут в INAF в 7:30 утра. Тестовый прием пищи будет состоять из завтрака-смузи, содержащего тот же йогурт (или соевый пудинг), который предоставлялся ежедневно в предшествующие дни. Образцы плазмы будут собраны на исходном уровне (натощак) и через 1, 2, 4 и 6 часов после приема пищи. Пробы будут взяты в пробирки с ЭДТА и храниться при -80°C.

Во время теста участникам будет дано указание заполнить валидированный самоадминистрируемый веб-опросник по 24-часовому отзыву о питании (R24W), специально валидированный для исследований среди взрослого населения Квебека [34-40]. Полная методология и валидация R24W опубликованы [34-40]. Кратко: R24W направляет участников указать все продукты и напитки, включая алкоголь, потребленные в предыдущий день. R24W позволяет выбирать потребленные продукты и напитки, просматривая структурированный список продуктов или используя поисковую систему. Он также содержит стандартизированные изображения для помощи в оценке размера порций. Эти данные будут использованы для сравнения эффективности R24W с эффективностью биомаркеров йогурта в оценке истинного содержания йогурта в диете.

Участники и ККИ не могут быть ослеплены в отношении распределения диет. Однако точное количество йогурта (или соевого пудинга) в диетах не будет раскрыто участникам. Четыре диеты будут случайным образом обозначены буквами (например, A=высокое содержание йогурта, B=соевый, C=низкое содержание йогурта, D=умеренное содержание йогурта). Этот подход минимизирует информационное смещение при заполнении R24W в конце каждого вмешательства. Каждое вмешательство будет разделено 1-недельным периодом вымывания, чтобы предоставить участникам перерыв, снижая риск выбывания, связанного с многонедельным вмешательством. В течение периода вымывания участникам будет дано указание вернуться к своей обычной диете. Мы не ожидаем какого-либо эффекта переноса диеты в период вымывания на последующие 7-дневные периоды вмешательства в отношении идентификации биомаркеров потребления йогурта. Действительно, идентификация биомаркера потребления йогурта будет использовать образцы плазмы, собранные на седьмой день каждого вмешательства, как в состоянии натощак, так и в постпрандиальном состоянии. Таким образом, крайне маловероятно, что биомаркер из пищи, потребленной в период вымывания, проявит острую постпрандиальную отзывчивость, ожидаемую для биомаркера потребления йогурта в рамках предложенной конструкции [27]. Общее участие в исследовании составит 7 недель. В конце исследования для каждого участника у нас будет всего 15 образцов плазмы, собранных после потребления йогурта (т.е. 5 образцов × 3 уровня потребления йогурта), и 5 образцов, собранных после диеты без йогурта, что в сумме составит 240 образцов после йогурта и 80 без йогурта (всего=320).

Соблюдение и ожидаемое выбывание: Будет предоставлен контрольный список для отслеживания ежедневного потребления пищи. Три полноценных приема пищи, потребляемых в INAF под наблюдением ККИ, будут способствовать соблюдению протокола. В наших предыдущих исследованиях с аналогичным дизайном было потреблено 99% предоставленных продуктов [28, 29], с лишь единичными отклонениями, все самоотчетными. Проф. Друэн-Шартье первоначально разработал и использовал то же 7-дневное меню в рамках полностью контролируемого РКИ, финансируемого CIHR, с участием 50 взрослых с гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией, с вмешательствами продолжительностью 4 недели. Соблюдение составило >99%, и диета была высоко оценена, без различий между участниками женского и мужского пола. Мы ранее проводили полностью контролируемые РКИ с кормлением большей продолжительности (например, 5×4 недели или 3×6 недель) с более инвазивными процедурами (например, биопсия кишечника) и диетами, менее типичными для канадских привычек (например, средиземноморская, без молочных продуктов), однако уровень выбывания никогда не превышал 20% [28, 29, 41]. Периоды вымывания снижают риск выбывания. Мы не ожидаем проблем с соблюдением. Мы запланировали включить 20 участников, ожидая, что как минимум 16 завершат полный протокол.

Процедуры набора: Критерии включения: возраст: 18-70 лет; ИМТ: 18-40 кг/м²; готовность потреблять натуральный йогурт ежедневно в течение 3 недель; для потребителей кофе/чая — готовность потреблять эти напитки без добавления молока, сливок или сахара в течение 4 недель. Критерии исключения: непереносимость лактозы; донорство крови в течение последних 2 месяцев; тяжелое хроническое заболевание или текущее лечение таких состояний, как инфекции, аутоиммунные заболевания, рак, диабет 2 типа, болезнь Крона, целиакия, заболевания печени или почек; история тяжелого рака, сердечно-сосудистых заболеваний или бариатрической хирургии; нестабильная масса тела в течение 3 месяцев; употребление запрещенных наркотиков или алкоголизм; курение/вейпинг табака/каннабиса (обеспечение отсутствия ежедневных колебаний и объективная отчетность о потреблении слишком сложны); аллергии или неприятие компонентов диет. Участники будут набираться из района города Квебек через массовые рассылки от INAF (охват: >5 000) и Университета Лаваля (>20 000). Заинтересованным лицам будет предложено связаться с ККИ для скринингового телефонного звонка. Подходящие лица будут затем приглашены на личную информационную сессию, где будут разъяснены все детали протокола. Заинтересованным будет предложено предоставить информированное согласие. После этого участники будут рандомизированы, и будет назначен базовый визит. Всего будет сгенерировано 10 различных последовательностей рандомизации с использованием дизайна Уильямса для обеспечения, чтобы каждое лечение следовало за каждым другим лечением равное количество раз. Каждая последовательность будет назначена одному участнику с учетом пола. Мы ожидаем, что исследование потребует 20 недель для завершения. INAF является домом для крупнейшего в Канаде подразделения клинических исследований в области питания (800 м²) и одним из немногих учреждений в стране, способных проводить полностью контролируемые РКИ. Он оснащен метаболической кухней, кафетерием, помещениями для сбора биологических образцов, электронной платформой для оценки питания, рандомизации и управления участниками, а также платформой метаболомики. В штате работает научная медсестра на полную ставку. Центр обработки данных ULaval обеспечивает безопасное хранение и аналитические возможности. Эта современная инфраструктура является ключевой для успеха проекта.

Метаболомное профилирование: После завершения исследования образцы плазмы будут обработаны на платформе метаболомики INAF с использованием четырех дополнительных методов ЖХ (положительная и отрицательная ионизация электрораспылением) для определения относительной обильности ~22 000 метаболитов. К ним относятся аминокислоты, сахара и малые органические кислоты (BEH Amide); метаболиты полифенолов и малые пептиды (HSS T3); свободные жирные кислоты и желчные кислоты (CSH C18); и липиды (BEH C8). В дополнение к образцам плазмы мы также обработаем образцы каждого из 4 йогуртов и соевого пудинга. Метаболомное профилирование будет проводиться с использованием Thermo Vanquish U-HPLC в сочетании с масс-спектрометром Thermo Fusion Tribrid Orbitrap или Waters Acquity I-Class UPLC в сочетании с Waters Synapt G2-Si, в зависимости от метода. Необработанные данные будут обработаны с использованием Compound Discoverer и Progenesis QI. Идентификация метаболитов будет выполнена с использованием постоянно растущего банка аналитических стандартов INAF (n=1 000 соединений, например, аминокислоты, метаболиты кишечного происхождения, желчные кислоты, фенольные соединения, жирные кислоты). Дополнительные хроматографические пики, представляющие интерес, пройдут предположительную идентификацию с использованием множественных спектральных и молекулярных баз данных (например, mzCloud, HMDB). Ожидается, что метаболомное профилирование займет 1 месяц.

Статистический анализ: Шаг 1: идентификация потенциальных биомаркеров потребления йогурта. Для этого мы стремимся идентифицировать все метаболиты, позволяющие различить диету, содержащую йогурт, и диету без йогурта. Независимые переменные будут включать относительную обильность всех метаболитов (n=22 000), измеренных после каждого из четырех вмешательств, с учетом образцов плазмы для каждого участника из настоящего исследования (320 наблюдений, из которых 80 без йогурта), и из нашего предыдущего исследования биомаркеров молока и сыра (n=284 образца плазмы без йогурта, обработанных с использованием тех же методов метаболомики; всего=604). Зависимой переменной будет «наличие йогурта в диете» (да/нет). Мы будем использовать алгоритм экстремального градиентного бустинга (XGBoost) для обучения классификационных моделей [42]. Итерационный процесс будет повторен n раз: (1) обучение моделей, (2) идентификация метаболита с наилучшей прогностической способностью, рассчитанной с помощью перестановочного тестирования, и (3) удаление этого метаболита перед следующей итерацией. Для каждой итерации будет обучено 25 моделей с использованием различных разделений участников на обучающую (80%; n=484 наблюдения) и тестовую (20%; n=120) выборки. Итерации будут продолжаться до тех пор, пока 95% доверительный интервал чувствительности или специфичности моделей не достигнет 0,5 (нулевая прогностическая сила классификационного алгоритма). В конце этого шага n удаленных метаболитов составят пул потенциальных биомаркеров потребления йогурта, которые будут сохранены для последующих шагов. Последующие шаги будут использовать стандартные статистические подходы для проверки ключевых характеристик валидированного биомаркера потребления пищи, как предложено FoodBALL. Если не указано иное, все следующие тесты будут проводиться с использованием смешанных моделей для повторных измерений, с относительной обильностью метаболита в качестве зависимой переменной. Модели будут скорректированы по возрасту, полу, индексу массы тела и общему суточному количеству калорий из диеты.

Шаг 2, грубая дозозависимость: Мы сравним относительную обильность каждого потенциального биомаркера после диет без йогурта и с йогуртом. Только метаболиты, чья обильность увеличивается с потреблением йогурта, перейдут к следующему шагу.

Шаг 3, уточненная дозозависимость: Мы сравним относительную обильность метаболитов на трех уровнях потребления йогурта, протестированных в исследовании. Метаболиты, показывающие значимую линейную тенденцию, при кодировании диеты без йогурта как 0, будут сохранены.

Шаг 4, временная отзывчивость: Используя данные образцов плазмы, собранных во время острого тестового приема пищи, мы оценим, увеличивается ли относительная обильность метаболитов со временем. Метаболиты с большей площадью под кривой (ППК) после потребления йогурта по сравнению с соевым пудингом будут сохранены.

Шаг 5, специфичность: Для подтверждения специфичности к йогурту метаболиты должны демонстрировать увеличение обильности с йогуртом, но не с молоком или сыром. Чтобы проверить это, мы будем использовать данные метаболомики, полученные в рамках предыдущего гранта DFC, которым руководил проф. Друэн-Шартье. В этом предыдущем проекте образцы плазмы, собранные в 4 ранее проведенных перекрестных РКИ с полным контролем питания, направленных на оценку влияния потребления молока или сыра в течение 4–6 недель на кардиометаболические факторы риска, использовались для идентификации метаболитных биомаркеров потребления молока и сыра отдельно. Этот набор данных включает данные метаболомики полностью контролируемых диет, содержащих молоко или сыр, и диеты без молочных продуктов для 118 человек. Метаболиты, чья обильность не увеличивается от молока или сыра, будут сохранены в конце этого шага. Это будет проведено без дополнительных затрат.

Шаг 6, устойчивость: Мы также будем использовать данные метаболомики, полученные в нашем прошлом гранте DFC. Они будут получены из поперечной когорты 200 взрослых, которые предоставили образец плазмы натощак и заполнили три 24-часовых отзыва о питании (R24W) на неделе, предшествующей взятию плазмы, включая один отчет об их потреблении пищи в день перед взятием плазмы. Участники будут разделены по медианному потреблению йогурта. Только метаболиты с большей обильностью у участников выше медианы будут сохранены. Этот шаг также не повлечет дополнительных затрат.

Шаг 7, правдоподобие: Мы оценим правдоподобие того, что сохраненные метаболиты происходят из йогурта, на основе их природы и химических структур, используя Базу данных по составу молока. Кроме того, мы сравним эти метаболиты с метаболомными профилями четырех протестированных йогуртов. После этого шага сохраненные метаболиты уже будут удовлетворять основным критериям FoodBALL для того, чтобы считаться валидированными биомаркерами потребления йогурта. Учитывая уникальные матричные особенности йогурта, мы уверены в идентификации как минимум одного метаболита, соответствующего всем критериям. В нашей предыдущей работе мы успешно идентифицировали один биомаркер для потребления молока (дельта-валеробетаин, специфический компонент молока) и девять различных других для потребления сыра.

Оценка эффективности: Сначала мы обучим модель для оценки потребления йогурта с использованием идентифицированных биомаркеров, сопоставляя их относительную обильность с известными уровнями потребления йогурта, предоставленными участникам во время исследования. Это будет сделано с использованием алгоритма Multimarker [43], который был специально разработан для моделирования потребления пищи на основе биомаркеров [44]. Модель сгенерирует калибровочное уравнение, которое мы будем использовать для калибровки данных 24-часового отзыва о питании и получения калиброванных по биомаркерам оценок потребления йогурта. Затем мы оценим точность оценок потребления йогурта, полученных с использованием: а) калибровочного уравнения (только биомаркеры), б) калиброванного 24-часового отзыва о питании (биомаркеры × самоотчетное потребление), и в) некалиброванного 24-часового отзыва о питании (только самоотчетное потребление), путем сравнения каждого с истинным потреблением, предоставленным в меню исследования. Мы сравним коэффициенты корреляции Пирсона и их 95% доверительные интервалы между методами с использованием t-тестов.