Identifisering av objektive metabolomikkbaserte biomarkører for yoghurtkonsum (YOGBIO)

Den amerikanske mat- og legemiddeltilsynet (FDA) har nylig vurdert at den vitenskapelige dokumentasjonen er tilstrekkelig robust til å godkjenne en søknad om en kvalifisert helsepåstand om yoghurt og redusert risiko for type 2-diabetes (T2D). I motsetning til dette har Health Canada ennå ikke godkjent en tilsvarende påstand. Den eksisterende dokumentasjonen er utelukkende hentet fra prospektive kohortstudier som baserer seg på selvrapporterte spørreskjemaer om kosthold, som – til tross for å være validerte – er utsatt for tilfeldige og systematiske feil som kan svekke dokumentasjonens kvalitet og hindre regulatorisk godkjenning.

Biomarkører for matinntak blir i økende grad anerkjent som verdifulle verktøy for å øke objektiviteten i ernæringsepidemiologi. Metabolomikk, den omfattende profilen av plasmametabolitter, anses som gullstandarden for å identifisere slike biomarkører. I sammenheng med meieriprodukter var en viktig milepæl identifiseringen av en metabolomisk signatur for yoghurtinntak i en stor spansk kohort. Denne signaturen – som består av 27 metabolitter (f.eks. C14:0 sfingomyelin, avledet fra myristinsyre) – var prediktiv for yoghurtinntak i en uavhengig amerikansk kohort og assosiert med lavere T2D-forekomst i begge populasjoner. Imidlertid, fordi denne signaturen ble avledet fra observasjonsdata, manglet den spesifisitet for yoghurtinntak.

Dette prosjektet søker å fylle dette kritiske gapet ved å oppdage spesifikke biomarkører for yoghurtinntak og validere dem mot anerkjente kriterier.

Vi vil gjennomføre en randomisert, krysset, dose-respons fôringsstudie med 16 generelt friske voksne (8 kvinner, 8 menn). Studien vil bestå av 4 forhåndsbestemte dieter, hver med varighet på 7 dager og atskilt med en 1-ukers utvaskingsperiode. På den 7. dagen av hver diett vil deltakerne gjennomgå en blandet måltidtest på INAF for å samle plasmaprøver i postprandial tilstand. De 4 diettene vil være basert på en meierifri bakgrunnsdiett som reflekterer høy overholdelse av Canadas kostholdsveiledning, med følgende tillegg:

1. 125 g per 2.380 kcal per dag av en soyabasert pudding (dvs. yoghurtfri diett);
2. 90 g per 2.380 kcal per dag av yoghurt (dvs. 0,5 referanseporsjon yoghurt per 2.380 kcal per dag);
3. 175 g per 2.380 kcal per dag av yoghurt (dvs. 1 referanseporsjon yoghurt per 2.380 kcal per dag);
4. 350 g per 2.380 kcal per dag av yoghurt (dvs. 2 referanseporsjoner per 2.380 kcal per dag).

For å sikre at de identifiserte biomarkørene reflekterer mangfoldet av yoghurttyper, vil fire yoghurtvarianter bli testet:

a) fettfri vanlig naturyoghurt; b) 2 % melkefett vanlig naturyoghurt; c) fettfri gresk naturyoghurt; d) 2 % melkefett gresk naturyoghurt. Hver yoghurttype vil bli tildelt fire deltakere, som vil konsumere samme type konsekvent gjennom hele studien. Målet er ikke å identifisere en distinkt biomarkør for hver yoghurttype, men å sikre at den/de identifiserte biomarkørene tar hensyn til mangfoldet av yoghurttyper. For den yoghurtfrie intervensjonen vil alle deltakerne konsumere den samme soyabaserte puddingen. Deltakerne vil fullføre de fire 7-dagers intervensjonene i tilfeldig rekkefølge. Dette designet sikrer at eventuelle observerte variasjoner i plasmametabolomet vil bli tilskrevet utelukkende yoghurt.

Under alle fire intervensjonene vil alle måltider og matvarer bli levert ved bruk av en 7-dagers syklisk meny, som tidligere gjort av vårt team [28-30]. Bakgrunnsdietten for hver intervensjon vil være identisk, meierifri (dvs. ekskluderer alle meieriprodukter og smør), og designet for å reflektere høy overholdelse av Canadas kostholdsveiledning, med vekt på minimalt bearbeidede plantebaserte matvarer. For å øke aksept og overholdelse vil menyen inkludere minst én oppskrift fra den offisielle Canadas kostholdsveiledningsdokumentasjonen hver dag [31, 32]. En erfaren matteknisk medarbeider vil tilberede diettene, med alle matvarer og ingredienser nøyaktig veid til nærmeste 0,1 g. I sammenheng med identifisering av inntaksbiomarkører ble naturyoghurt ansett som det mest passende valget i stedet for smaksatt yoghurt. Imidlertid er naturyoghurt mindre velsmakende på grunn av dens sure smak. For å håndtere dette vil bakgrunnsdietten inkludere en daglig porsjon små frukter som deltakerne vil bli instruert om å enten blande inn i yoghurten (eller soyapuddingen) eller konsumere sammen med. Siden fruktporsjonen vil være standardisert og konsumert i konsistente mengder hver dag på tvers av de fire intervensjonene, vil den ikke introdusere forvirrende faktorer i yoghurtbiomarkøridentifiseringsprosessen. Vi anser denne tilnærmingen også som gunstig for å sikre overholdelse under dietten som inneholder soyabasert pudding.

På tvers av de fire yoghurttypene og tre nivåer av inntak, vil yoghurt bidra med i gjennomsnitt 120 kcal/dag, det samme vil kontrollsoyapuddingen. Det laveste kaloribidraget vil være 40 kcal (fettfri vanlig naturyoghurt, 90 g/dag), og det høyeste vil være 240 kcal (2 % melkefett gresk naturyoghurt; 350 g/dag). Disse kaloriene vil bli lagt til en 2.380 kcal/dag bakgrunnsdiett for å skape en standardisert meny som i gjennomsnitt vil utgjøre 2.500 kcal/dag på tvers av de fire intervensjonene. Gitt at intervensjonene bare varer i syv dager, er det usannsynlig at forskjellen i kaloribidraget fra yoghurtene eller soyapuddingen vil påvirke kroppsvekt eller introdusere forvirrende faktorer. Den foreslåtte tilnærmingen – å legge de testede matvarene til en identisk isoenergetisk bakgrunnsdiett – er den optimale strategien. For en enkelt deltaker vil den eneste forskjellen mellom de fire diettene være yoghurtinnholdet, noe som sikrer at eventuelle etter-diett-forskjeller i plasmametabolomet utelukkende kan tilskrives yoghurt. Omvendt, hvis vi valgte å opprettholde et lignende totalt kaloriinnhold i bakgrunnsdietten på tvers av de fire fasene, ville endringer i bakgrunnsdietten være nødvendig, noe som ville introdusere skjevhet i plasmametabolomet. Ved baseline vil deltakernes energibehov bli estimert ved bruk av validerte prediktive ligninger [33], og det totale energiinnholdet i diettene vil bli justert tilsvarende for å oppfylle disse behovene.

Under hver av de fire 7-dagers intervensjonene vil deltakerne være pålagt å konsumere minst tre fulle måltider på INAF under klinisk forskningskoordinator (KFK)s tilsyn. Under disse besøkene vil de også motta sine måltider for de neste 24 til 72 timene. Deltakerne vil bli instruert om å kun konsumere de leverte matvarene og å konsumere alle måltider som levert. Alkohol, vitamintilskudd og naturlige helseprodukter vil ikke være tillatt. Te og kaffe (≤2 kopper/dag) vil være tillatt, uten daglige fluktuasjoner og uten melk, fløte eller sukker. Ubegrenset mengde vann vil være tillatt. Deltakerne vil bli instruert om å opprettholde sitt vanlige fysiske aktivitetsnivå stabilt for hele protokollen. På den 7. dagen av hver diett vil deltakerne gjennomgå en akutt blandet måltidtest for å informere om tidsresponsiviteten til yoghurtbiomarkørene. Etter en 12-timers faste vil deltakerne ankomme INAF klokken 07:30. Testmåltidet vil bestå av en frokost-smoothie som inneholder den samme yoghurten (eller soyabaserte puddingen) som ble levert daglig i de foregående dagene. Plasmaprøver vil bli samlet ved baseline (fastende) og 1, 2, 4 og 6 timer etter måltidet. Prøver vil bli tatt opp i EDTA-rør og lagret ved -80°C.

Under testen vil deltakerne bli instruert om å fullføre et valider selvadministrert nettbasert 24-timers kostholdsopptak (R24W), spesifikt validert for forskning blant voksne i Quebec [34-40]. Den fulle metodologien og valideringen bak R24W er publisert [34-40]. Kort fortalt veileder R24W deltakerne til å angi alle matvarer og drikkevarer, inkludert alkohol, konsumert dagen før. R24W lar en velge matvarer og drikkevarer konsumert ved å bla gjennom en strukturert liste over matvarer eller ved å bruke en søkemotor. Den inneholder også standardiserte bilder for å hjelpe med å vurdere porsjonsstørrelser. Disse dataene vil bli brukt til å sammenligne ytelsen til R24W med yoghurtbiomarkørene i å estimere det sanne yoghurtinnholdet i dietten.

Deltakere og KFK kan ikke være blindet for dietttildeling. Imidlertid vil den eksakte mengden yoghurt (eller soyabasert pudding) i diettene ikke bli opplyst til deltakerne. De fire diettene vil bli tilfeldig merket med bokstaver (f.eks. A=høy yoghurt, B=soya, C=lav yoghurt, D=moderat yoghurt). Denne tilnærmingen vil minimere informasjonsskjevhet for fullføringen av R24W ved slutten av hver intervensjon. Hver intervensjon vil være atskilt med en 1-ukers utvaskingsperiode, for å gi deltakerne en pause, og redusere risikoen for frafall assosiert med en flerukers intervensjon. Under utvaskingsperioden vil deltakerne bli instruert om å gå tilbake til sin vanlige diett. Vi forventer ikke noen bæreover-effekter av dietten under utvaskingsperioden på de påfølgende 7-dagers intervensjonsperiodene med hensyn til yoghurtinntaksbiomarkøridentifisering. Faktisk vil identifiseringen av yoghurtinntaksbiomarkør utnytte plasmaprøvene samlet på dag syv av hver intervensjon, både i fastende og postprandial tilstand. Derfor er det svært usannsynlig at en biomarkør fra mat konsumert under utvaskingsperioden vil utvise den akutte postprandiale responsiviteten forventet for yoghurtinntaksbiomarkøren under det foreslåtte designet [27]. Total studie-deltakelse vil være på 7 uker. Ved slutten av studien vil vi for hver deltaker ha totalt 15 plasmaprøver samlet etter yoghurtkonsum (dvs. 5 prøver x 3 nivåer av yoghurtinntak) og 5 prøver samlet etter den yoghurtfrie dietten, for totalt 240 etter-yoghurt prøver og 80 uten yoghurt (total=320).

Overholdelse og forventede frafall: En sjekkliste vil bli gitt for å spore daglig matkonsum. Å ha 3 fulle måltider konsumert på INAF under KFKs tilsyn vil forsterke overholdelse til protokollen. I våre tidligere studier med lignende design ble 99 % av de leverte matvarene konsumert [28, 29], med kun anekdotiske avvik, alle selvrapporterte. Prof. Drouin-Chartier utviklet opprinnelig og brukte den samme 7-dagers menyen innenfor en CIHR-finansiert fullt fôret RCT i 50 voksne med heterozygot familiær hyperkolesterolemi, med intervensjoner som varte i 4 uker. Overholdelsen var >99 % og dietten var svært godt likt, uten forskjeller mellom kvinnelige og mannlige deltakere. Vi har tidligere gjennomført fullt kontrollerte fôrings-RCT-er av lengre varighet (f.eks. 5×4 uker eller 3×6 uker) med mer invasive prosedyrer (f.eks. tarmbiopsier) og dietter mindre typiske for kanadiske vaner (f.eks. middelhavs-, meierifri), likevel oversteg frafallsratene aldri 20 % [28, 29, 41]. Utvaskingsperiodene reduserer frafallsrisiko. Vi forventer ingen overholdselsproblemer. Vi planla å rekruttere 20 deltakere, og forventer at minst 16 vil fullføre hele protokollen.

Rekrutteringsprosedyrer: Inklusjonskriterier: alder: 18-70 år; BMI: 18-40 kg/m²; villighet til å konsumere naturyoghurt daglig i 3 uker; for kaffe/te-forbrukere, villighet til å konsumere disse drikkene uten tilsatt melk, fløte eller sukker i 4 uker. Eksklusjonskriterier: laktoseintoleranse; bloddonasjon innen 2 måneder; alvorlig kronisk sykdom eller pågående behandling for tilstander som infeksjoner, autoimmun sykdom, kreft, type 2-diabetes, Crohns sykdom, cøliaki, leversykdom eller nyresykdom; historie med alvorlig kreft, hjerte- og karsykdom eller fedmekirurgi; ustabil kroppsvekt i 3 måneder; ulovlig rusmiddelbruk eller alkoholisme; tobakk/cannabis-røyking/damping (å sikre ingen dag-til-dag fluktuasjoner og objektiv rapportering av konsum er for komplekst); allergier eller aversjoner mot komponenter i diettene. Deltakere vil bli rekruttert fra Quebec City-området gjennom masse-e-poster fra INAF (rekkevidde: >5.000) og Université Laval (>20.000). Interesserte personer vil bli invitert til å kontakte KFK for et screening-telefonsamtale. Kvalifiserte personer vil deretter bli invitert til et personlig informasjonsmøte, hvor alle detaljer i protokollen vil bli forklart. De som er interessert vil bli bedt om å gi informert samtykke. Etterpå vil deltakerne bli randomisert, og et baseline-besøk vil bli planlagt. Totalt 10 forskjellige randomiseringssekvenser vil bli generert ved bruk av Williams-design for å sikre at hver behandling følger hver annen behandling like mange ganger. Hver sekvens vil bli tildelt en enkelt deltaker, på en kjønnsspesifikk måte. Vi forventer at studien vil kreve 20 uker å fullføre. INAF er hjemsted for Canadas største kliniske ernæringsforskningsenhet (800 m²), og en av de få fasilitetene i landet som er i stand til fullt kontrollerte RCT-er. Den har et metabolisk kjøkken, kafeteria, rom for innsamling av biologiske prøver, en e-plattform for kostholdsvurdering, deltakerrandomisering og administrasjon, og en metabolomikk-plattform. En heltids forskningssykepleier er på ansatt. ULavals datasenter sikrer sikker lagring og analytisk kapasitet. Denne toppmoderne infrastrukturen er nøkkelen til prosjektets suksess.

Metabolomikk-profilering: Når studien er fullført, vil plasmaprøver bli prosessert på INAF metabolomikk-plattformen ved bruk av fire komplementære LC-metoder (positiv og negativ elektrospray-ionisering) for å bestemme den relative abundansen av ~22.000 metabolitter. Disse inkluderer aminosyrer, sukkerarter og små organiske syrer (BEH Amide); polyfenolmetabolitter og små peptider (HSS T3); frie fettsyrer og gallsyrer (CSH C18); og lipider (BEH C8). I tillegg til plasmaprøver vil vi også prosessere prøver av hver av de 4 yoghurttypene og soyapuddingen. Metabolomikk-profilering vil bli utført ved bruk av en Thermo Vanquish U-HPLC koblet til en Thermo Fusion Tribrid Orbitrap massespektrometer eller en Waters Acquity I-Class UPLC koblet til en Waters Synapt G2-Si, avhengig av metoden. Rådata vil bli prosessert ved bruk av Compound Discoverer og Progenesis QI. Metabolittidentifikasjon vil bli utført ved bruk av den stadig voksende INAF analytiske standardbanken (n=1.000 forbindelser, f.eks. aminosyrer, tarmavledede metabolitter, gallsyrer, fenoliske forbindelser, fettsyrer). Ytterligere kromatografiske topper av interesse vil gjennomgå antatt identifikasjon ved bruk av flere spektrale og molekylære databaser (f.eks. mzCloud, HMDB). Metabolomikk-profilering forventes å ta 1 måned.

Statistiske analyser: Trinn 1: identifikasjon av potensielle biomarkører for yoghurtinntak. For å gjøre dette, har vi som mål å identifisere alle metabolitter som tillater å skille mellom en yoghurtinneholdende og en yoghurtfri diett. Uavhengige variabler vil inkludere den relative abundansen av alle metabolitter (n=22.000) målt etter hver av de fire intervensjonene, med tanke på plasmaprøver for hver deltaker fra den nåværende studien (320 observasjoner, hvorav 80 er yoghurtfrie), og fra vår tidligere melk- og ost-biomarkørstudie (n=284 yoghurtfrie plasmaprøver, prosessert ved bruk av de samme metabolomikk-metodene; total=604). Den avhengige variabelen vil være "tilstedeværelse av yoghurt i dietten" (ja/nei). Vi vil bruke extreme gradient boosting-algoritmen (XGBoost) for å trene klassifiseringsmodeller [42]. En iterativ prosess vil bli gjentatt n ganger: (1) trene modellene, (2) identifisere metabolitten med den beste prediktive evnen, beregnet ved permutasjonstesting, og (3) fjerne denne metabolitten før neste iterasjon. For hver iterasjon vil 25 modeller bli trent ved bruk av forskjellige delinger av deltakere i trenings- (80 %; n=484 observasjoner) og test-sett (20 %; n=120). Iterasjonene vil fortsette til sensitiviteten eller spesifisiteten 95 % konfidensintervall av modellene når 0,5 (null prediktiv kraft av en klassifiseringsalgoritme). Ved slutten av dette trinnet vil de n fjernede metabolittene utgjøre puljen av potensielle biomarkører for yoghurtinntak, som vil bli beholdt for påfølgende trinn. De påfølgende trinnene vil utnytte standard statistiske tilnærminger for å teste nøkkelegenskapene til en validert biomarkør for matinntak, som foreslått av FoodBALL. Med mindre annet er spesifisert, vil alle følgende tester bli utført ved bruk av blandede modeller for gjentatte mål, med metabolitt relativ abundans som den avhengige variabelen. Modellene vil bli justert for alder, kjønn, kroppsmasseindeks og totale daglige kalorier fra dietten.

Trinn 2, grov dose-responsivitet: Vi vil sammenligne den relative abundansen av hver potensiell biomarkør etter yoghurtfrie og yoghurtinneholdende dieter. Kun metabolitter hvis abundans øker med yoghurtkonsum vil gå videre til neste trinn.

Trinn 3, raffinert dose-responsivitet: Vi vil sammenligne den relative abundansen av metabolitter på tvers av de tre nivåene av yoghurtinntak testet i studien. Metabolitter som viser en signifikant lineær trend, med den yoghurtfrie dietten kodet som 0, vil bli beholdt.

Trinn 4, tids-responsivitet: Ved bruk av data fra plasmaprøver samlet under den akutte testmåltidet, vil vi vurdere om den relative abundansen av metabolitter øker over tid. Metabolitter med et større areal under kurven (AUC) etter yoghurtinntak sammenlignet med soyapuddingen vil bli beholdt.

Trinn 5, spesifisitet: For å bekrefte spesifisitet til yoghurt, må metabolitter vise økt abundans med yoghurt men ikke med melk eller ost. For å teste dette vil vi bruke metabolomikk-data generert fra det forrige DFC-stipendet holdt av Prof. Drouin-Chartier. I dette forrige prosjektet ble plasmaprøver samlet fra 4 tidligere gjennomførte krysset RCT-er med full fôringsinnstillinger som hadde som mål å evaluere virkningen av melk- eller ostinntak over 4 til 6 uker på kardiometabole risikofaktorer brukt til å identifisere metabolittbiomarkører for melk- og ostinntak, separat. Dette datasettet omfatter metabolomikk-data fra fullt kontrollerte melk- eller ostinneholdende dieter og en meierifri diett for 118 individer. Metabolitter hvis abundans ikke økes av melk eller ost vil bli beholdt ved slutten av dette trinnet. Dette vil bli utført uten ekstra kostnad.

Trinn 6, robusthet: Vi vil også bruke metabolomikk-data generert i vårt tidligere DFC-stipend. Disse vil komme fra en tverrsnittskohort på 200 voksne som ga en fastende plasmaprøve og fullførte tre 24-timers kostholdsopptak (R24W) i uken før plasmaprøvetaking, inkludert en som rapporterte om sine kostholdsinntak dagen før plasmaprøvetaking. Deltakere vil bli delt ved median yoghurtinntak. Kun metabolitter med større abundans i deltakere over medianen vil bli beholdt. Dette trinnet vil også medføre ingen ekstra kostnad.

Trinn 7, plausibilitet: Vi vil vurdere plausibiliteten til de beholdte metabolittene som stammer fra yoghurt basert på deres natur og kjemiske strukturer, ved bruk av Melkesammensetningsdatabasen. I tillegg vil vi sammenligne disse metabolittene med metabolomikk-profilene til de fire testede yoghurttypene. Etter dette trinnet vil de beholdte metabolittene allerede ha tilfredsstilt FoodBALLs essensielle kriterier for å bli ansett som validerte biomarkører for yoghurtinntak. Gitt yoghurts unike matriksfunksjoner, er vi sikre på å identifisere minst en metabolitt som oppfyller alle kriterier. I vårt tidligere arbeid identifiserte vi med hell en biomarkør for melkinntak (delta-valerobetain, en melkspesifikk komponent) og ni andre for ostinntak.

Ytelsesevaluering: Vi vil først trene en modell for å estimere yoghurtinntak ved bruk av de identifiserte biomarkørene ved å sammenligne deres relative abundans med de kjente yoghurtinntaksnivåene gitt til deltakere under studien. Dette vil bli gjort ved bruk av Multimarker-algoritmen [43], som ble spesifikt utviklet for å modellere matinntak basert på biomarkører [44]. Modellen vil generere en kalibreringsligning som vi vil bruke til å kalibrere 24-timers kostholdsopptakdata og produsere biomarkør-kalibrerte estimater av yoghurtinntak. Deretter vil vi evaluere nøyaktigheten av yoghurtinntak estimater oppnådd ved bruk av: a) kalibreringsligningen (biomarkører alene), b) den kalibrerte 24-timers kostholdsopptaket (biomarkører × selvrapportert inntak), og c) det ukalibrerte 24-timers kostholdsopptaket (selvrapportert inntak alene), ved å sammenligne hver med det sanne inntaket gitt i studiemenyene. Vi vil sammenligne Pearson korrelasjonskoeffisienter og deres 95 % konfidensintervaller på tvers av metoder ved bruk av t-tester.