识别基于客观代谢组学的酸奶消费生物标志物 (YOGBIO)

美国食品药品监督管理局近期认定科学证据足够充分，批准了关于酸奶与降低2型糖尿病风险之间的合格健康声称申请。 相比之下，加拿大卫生部尚未批准类似声称。 现有证据完全基于依赖自我报告饮食问卷的前瞻性队列研究，这些问卷虽经验证，但仍存在随机和系统误差，可能损害证据质量并阻碍监管批准。

食物摄入生物标志物日益被认为是提升营养流行病学客观性的重要工具。 代谢组学，即血浆代谢物的全面分析，被视为识别此类生物标志物的金标准。 在乳制品领域，一个重要里程碑是在一个大型西班牙队列中识别出了酸奶摄入的代谢组学特征。 该特征包含27种代谢物（例如，来源于肉豆蔻酸的C14:0鞘磷脂），在一个独立的美国队列中能预测酸奶摄入，并在两个人群中与较低的2型糖尿病发病率相关。 然而，由于该特征源自观察性数据，它缺乏对酸奶摄入的特异性。

本项目旨在通过发现酸奶摄入的特异性生物标志物并根据公认标准进行验证，来填补这一关键空白。

我们将进行一项随机、交叉、剂量反应喂养试验，涉及16名基本健康的成年人（8名女性，8名男性）。 试验将包括4种预定饮食，每种持续7天，间隔1周洗脱期。 每种饮食的第7天，参与者将在INAF进行混合餐测试，以收集餐后血浆样本。 4种饮食将基于反映高度遵循加拿大食品指南的无乳制品背景饮食，并添加以下内容：

1. 每2,380千卡/天125克大豆布丁（即无酸奶饮食）；
2. 每2,380千卡/天90克酸奶（即每2,380千卡/天0.5份参考酸奶）；
3. 每2,380千卡/天175克酸奶（即每2,380千卡/天1份参考酸奶）；
4. 每2,380千卡/天350克酸奶（即每2,380千卡/天2份参考酸奶）。

为确保识别的生物标志物反映酸奶的多样性，将测试四种酸奶类型：

a) 脱脂原味普通酸奶；b) 2%乳脂原味普通酸奶；c) 脱脂原味希腊酸奶；d) 2%乳脂原味希腊酸奶。 每种酸奶类型将分配给四名参与者，他们在整个研究期间将始终食用同一种类型。 目标不是为每种酸奶类型识别独特的生物标志物，而是确保识别的生物标志物能解释酸奶类型的多样性。 对于无酸奶干预，所有参与者将食用相同的大豆布丁。 参与者将以随机顺序完成四次为期7天的干预。 这种设计确保血浆代谢组中观察到的任何变化仅归因于酸奶。

在所有四次干预期间，所有餐食和食物将使用7天循环菜单提供，如我们团队先前所做[28-30]。 每次干预的背景饮食将相同、无乳制品（即排除所有乳制品和黄油），并设计为反映高度遵循加拿大食品指南，强调最低限度加工的植物性食品。 为提升可接受性和依从性，菜单将每天至少包含一份来自加拿大食品指南官方文件的食谱[31, 32]。 经验丰富的食品技术员将准备饮食，所有食物和配料精确称重至0.1克。 在摄入生物标志物识别背景下，原味酸奶被视为比风味酸奶更合适的选择。 然而，原味酸奶因其酸味而口感较差。 为解决此问题，背景饮食将包括每日一份小份水果，参与者将被指示将其混入酸奶（或大豆布丁）中或一同食用。 由于水果份量将标准化且在四次干预中每天消耗量一致，它不会在酸奶生物标志物识别过程中引入混淆。 我们认为这种方法也有利于确保在含大豆布丁饮食期间的依从性。

在四种酸奶类型和三个摄入水平中，酸奶平均贡献120千卡/天，对照大豆布丁亦如此。 最低热量贡献为40千卡（脱脂原味普通酸奶，90克/天），最高为240千卡（2%乳脂原味希腊酸奶；350克/天）。 这些热量将添加到2,380千卡/天的背景饮食中，创建一个标准化菜单，在四次干预中平均达到2,500千卡/天。 鉴于干预仅持续七天，酸奶或大豆布丁热量贡献的差异不太可能影响体重或引入混淆。 所提出的方法——将测试食物添加到相同的等能量背景饮食中——是最佳策略。 对于单个参与者，四种饮食之间的唯一差异将是酸奶含量，确保饮食后血浆代谢组的任何差异仅归因于酸奶。 相反，如果我们选择在四个阶段保持背景饮食总热量相似，则需要对背景饮食进行调整，这将在血浆代谢组中引入偏倚。 基线时，参与者的能量需求将使用经验证的预测方程估算[33]，饮食的总能量含量将相应调整以满足这些需求。

在四次为期7天的干预期间，参与者将被要求在临床研究协调员的监督下，在INAF至少食用三顿完整餐食。 在这些访问期间，他们还将收到未来24至72小时的餐食。 参与者将被指示仅食用提供的食物，并按供应食用所有餐食。 酒精、维生素补充剂和天然健康产品将不允许。 茶和咖啡（≤2杯/天）将被允许，每日无波动且不加牛奶、奶油或糖。 无限量水将被允许。 参与者将被指示在整个方案期间保持其通常的身体活动水平稳定。 每种饮食的第7天，参与者将进行急性混合餐测试，以了解酸奶生物标志物的时间反应性。 禁食12小时后，参与者将在上午7:30到达INAF。 测试餐将包含一份早餐冰沙，内含前几日每日提供的相同酸奶（或大豆布丁）。 血浆样本将在基线（空腹）及餐后1、2、4和6小时采集。 样本将采集到EDTA管中并储存在-80°C。

测试期间，参与者将被指示完成一份经验证的自我管理网络版24小时饮食回忆（R24W），该工具专门针对魁北克成年人研究进行了验证[34-40]。 R24W的完整方法和验证已发表[34-40]。 简而言之，R24W引导参与者指出前一天消费的所有食物和饮料，包括酒精。 R24W允许通过浏览结构化食物列表或使用搜索引擎选择消费的食物和饮料。 它还包含标准化图像以帮助评估份量大小。 这些数据将用于比较R24W与酸奶生物标志物在估算饮食中真实酸奶含量方面的表现。

参与者和临床研究协调员无法对饮食分配设盲。 然而，饮食中酸奶（或大豆布丁）的确切量不会向参与者透露。 四种饮食将随机用字母标记（例如，A=高酸奶，B=大豆，C=低酸奶，D=中酸奶）。 这种方法将最小化每次干预结束时完成R24W的信息偏倚。 每次干预将间隔1周洗脱期，为参与者提供休息，降低与多周干预相关的退出风险。 洗脱期间，参与者将被指示恢复其通常饮食。 我们预计洗脱期的饮食对后续7天干预期间酸奶摄入生物标志物识别不会产生任何残留效应。 实际上，酸奶摄入生物标志物的识别将利用每次干预第7天采集的血浆样本，包括空腹和餐后状态。 因此，洗脱期消耗的食物中的生物标志物极不可能表现出所设计下酸奶摄入生物标志物预期的急性餐后反应性[27]。 试验总参与时间为7周。 试验结束时，对于每位参与者，我们将有总共15个酸奶消耗后采集的血浆样本（即5个样本×3个酸奶摄入水平）和5个无酸奶饮食后采集的样本，总计240个酸奶后样本和80个无酸奶样本（总计=320）。

依从性和预期退出：将提供检查表以追踪每日食物消耗。 在临床研究协调员监督下在INAF食用3顿完整餐食将加强方案依从性。 在我们先前类似设计的研究中，99%的提供食物被消耗[28, 29]，仅有个别偏差，均为自我报告。 Drouin-Chartier教授最初在加拿大卫生研究院资助的一项完全喂养随机对照试验中开发并使用了相同的7天菜单，涉及50名杂合子家族性高胆固醇血症成人，干预持续4周。 依从性>99%，饮食备受好评，女性和男性参与者无差异。 我们先前进行过更长时间（例如，5×4周或3×6周）的完全控制喂养随机对照试验，涉及更具侵入性的程序（例如，肠道活检）和更不符合加拿大习惯的饮食（例如，地中海式、无乳制品），但退出率从未超过20%[28, 29, 41]。 洗脱期降低了退出风险。 我们预计不会有依从性问题。 我们计划招募20名参与者，预计至少16名完成完整方案。

招募程序：纳入标准：年龄：18-70岁；BMI：18-40公斤/平方米；愿意每日食用原味酸奶3周；对于咖啡/茶消费者，愿意在4周内不添加牛奶、奶油或糖饮用这些饮料。 排除标准：乳糖不耐受；2个月内献血；严重慢性疾病或正在接受治疗，如感染、自身免疫性疾病、癌症、2型糖尿病、克罗恩病、乳糜泻、肝脏或肾脏疾病；严重癌症、心血管疾病或减肥手术史；3个月内体重不稳定；非法药物使用或酒精中毒；烟草/大麻吸烟/电子烟（确保无日常波动且客观报告消费过于复杂）；对饮食成分过敏或厌恶。 参与者将从魁北克市地区通过INAF（覆盖范围：>5,000人）和拉瓦尔大学（>20,000人）的群发邮件招募。 感兴趣的个人将被邀请联系临床研究协调员进行筛选电话。 符合条件的个人将被邀请参加面对面信息会议，详细解释方案细节。 感兴趣者将被要求提供知情同意。 之后，参与者将被随机分组，并安排基线访问。 将使用Williams设计生成10种不同的随机序列，确保每种处理在其他每种处理之后出现相同次数。 每种序列将分配给单个参与者，按性别特定方式。 我们预计试验需要20周完成。 INAF是加拿大最大的临床营养研究单位（800平方米）所在地，也是国内少数能进行完全控制随机对照试验的设施之一。 它设有代谢厨房、自助餐厅、生物样本采集空间、饮食评估电子平台、参与者随机分组和管理平台以及代谢组学平台。 配备全职研究护士。 拉瓦尔大学数据中心确保安全存储和分析能力。 这种先进基础设施是项目成功的关键。

代谢组学分析：试验完成后，血浆样本将在INAF代谢组学平台使用四种互补液相色谱方法（正负电喷雾电离）处理，以测定约22,000种代谢物的相对丰度。 这些包括氨基酸、糖类和小有机酸（BEH Amide）；多酚代谢物和小肽（HSS T3）；游离脂肪酸和胆汁酸（CSH C18）；以及脂质（BEH C8）。 除血浆样本外，我们还将处理四种酸奶和大豆布丁的样本。 代谢组学分析将使用Thermo Vanquish U-HPLC联用Thermo Fusion Tribrid Orbitrap质谱仪或Waters Acquity I-Class UPLC联用Waters Synapt G2-Si进行，具体取决于方法。 原始数据将使用Compound Discoverer和Progenesis QI处理。 代谢物鉴定将使用不断增长的INAF分析标准品库（n=1,000种化合物，例如，氨基酸、肠道来源代谢物、胆汁酸、酚类化合物、脂肪酸）。 感兴趣的额外色谱峰将使用多个光谱和分子数据库（例如，mzCloud、HMDB）进行推定鉴定。 代谢组学分析预计需要1个月。

统计分析：步骤1：识别酸奶摄入的潜在生物标志物。 为此，我们旨在识别所有能区分含酸奶饮食与无酸奶饮食的代谢物。 自变量将包括所有代谢物（n=22,000）的相对丰度，测量自四次干预后，考虑本试验中每位参与者的血浆样本（320个观测值，其中80个无酸奶），以及我们先前牛奶和奶酪生物标志物研究的数据（n=284个无酸奶血浆样本，使用相同代谢组学方法处理；总计=604）。 因变量将为“饮食中是否含酸奶”（是/否）。 我们将使用极端梯度提升算法训练分类模型[42]。 迭代过程将重复n次：（1）训练模型，（2）识别具有最佳预测能力的代谢物，通过置换测试计算，（3）在下一次迭代前移除该代谢物。 每次迭代中，将训练25个模型，使用参与者划分为训练集（80%；n=484个观测值）和测试集（20%；n=120）的不同分割。 迭代将持续到模型的敏感性或特异性95%置信区间达到0.5（分类算法的无效预测能力）。 此步骤结束时，n个移除的代谢物将构成酸奶摄入潜在生物标志物池，将保留用于后续步骤。 后续步骤将利用标准统计方法测试已验证食物摄入生物标志物的关键特征，如FoodBALL所提出。 除非另有说明，所有以下测试将使用重复测量混合模型，以代谢物相对丰度为因变量。 模型将调整年龄、性别、体重指数和饮食总热量。

步骤2，粗略剂量反应性：我们将比较无酸奶和含酸奶饮食后每种潜在生物标志物的相对丰度。 仅丰度随酸奶消耗增加的代谢物将进入下一步。

步骤3，精细剂量反应性：我们将比较研究测试的三个酸奶摄入水平下代谢物的相对丰度。 显示显著线性趋势的代谢物将被保留，无酸奶饮食编码为0。

步骤4，时间反应性：使用急性测试餐期间采集的血浆样本数据，我们将评估代谢物相对丰度是否随时间增加。 酸奶摄入后曲线下面积大于大豆布丁的代谢物将被保留。

步骤5，特异性：为确认对酸奶的特异性，代谢物必须显示随酸奶丰度增加，但不随牛奶或奶酪增加。 为测试此点，我们将使用Drouin-Chartier教授先前DFC资助项目生成的代谢组学数据。 在此先前项目中，血浆样本来自4项先前进行的交叉随机对照试验，采用完全喂养设置，旨在评估4至6周牛奶或奶酪摄入对心脏代谢风险因素的影响，用于分别识别牛奶和奶酪摄入的代谢物生物标志物。 该数据集包含118名个体在完全控制含牛奶或奶酪饮食及无乳制品饮食下的代谢组学数据。 丰度不随牛奶或奶酪增加的代谢物将在此步骤结束时被保留。 此步骤将无额外成本。

步骤6，稳健性：我们还将使用过去DFC资助项目中生成的代谢组学数据。 这些数据将来自一个200名成人的横断面队列，他们提供了空腹血浆样本，并在血浆采样前一周完成了三次24小时饮食回忆，其中一次报告采样前一天的饮食摄入。 参与者将按酸奶摄入中位数分组。 仅丰度在中位数以上参与者中更高的代谢物将被保留。 此步骤亦无额外成本。

步骤7，合理性：我们将根据其性质和化学结构，使用乳成分数据库评估保留代谢物源自酸奶的合理性。 此外，我们将这些代谢物与四种测试酸奶的代谢组学谱进行比较。 此步骤后，保留的代谢物将已满足FoodBALL关于被视为已验证酸奶摄入生物标志物的基本标准。 鉴于酸奶独特的基质特征，我们有信心识别至少一种满足所有标准的代谢物。 在我们先前工作中，我们成功识别了一种牛奶摄入生物标志物（δ-戊基甜菜碱，一种牛奶特有成分）和九种不同的奶酪摄入生物标志物。

性能评估：我们将首先训练一个模型，通过交叉参考识别的生物标志物相对丰度与试验期间提供给参与者的已知酸奶摄入水平，来估算酸奶摄入。 这将使用Multimarker算法完成[43]，该算法专门为基于生物标志物建模食物摄入而开发[44]。 模型将生成一个校准方程，我们将用于校准24小时饮食回忆数据，并生成生物标志物校准的酸奶摄入估计。 接下来，我们将通过比较每种方法与研究菜单中提供的真实摄入，评估使用以下方法获得的酸奶摄入估计的准确性：a) 校准方程（仅生物标志物），b) 校准的24小时饮食回忆（生物标志物×自我报告摄入），c) 未校准的24小时饮食回忆（仅自我报告摄入）。 我们将使用t检验比较不同方法间的Pearson相关系数及其95%置信区间。