Identification de biomarqueurs objectifs basés sur la métabolomique de la consommation de yaourt (YOGBIO)

La Food and Drug Administration des États-Unis a récemment jugé les preuves scientifiques suffisamment solides pour approuver une pétition relative à une allégation santé qualifiée concernant le yaourt et la réduction du risque de diabète de type 2 (DT2). En revanche, Santé Canada n'a pas encore approuvé une allégation similaire. Les preuves existantes proviennent exclusivement d'études de cohorte prospectives s'appuyant sur des questionnaires alimentaires autodéclarés, qui - bien que validés - sont sujets à des erreurs aléatoires et systématiques pouvant compromettre la qualité des preuves et entraver l'approbation réglementaire.

Les biomarqueurs de consommation alimentaire sont de plus en plus reconnus comme des outils précieux pour améliorer l'objectivité en épidémiologie nutritionnelle. La métabolomique, le profilage complet des métabolites plasmatiques, est considérée comme la référence pour l'identification de tels biomarqueurs. Dans le contexte des produits laitiers, une étape majeure a été l'identification d'une signature métabolomique de la consommation de yaourt dans une large cohorte espagnole. Cette signature - comprenant 27 métabolites (par exemple, la sphingomyéline C14:0, dérivée de l'acide myristique) - était prédictive de la consommation de yaourt dans une cohorte américaine indépendante et associée à une incidence plus faible de DT2 dans les deux populations. Cependant, parce que cette signature a été dérivée de données observationnelles, elle manquait de spécificité pour la consommation de yaourt.

Ce projet vise à combler cette lacune critique en découvrant des biomarqueurs spécifiques de la consommation de yaourt et en les validant selon des critères reconnus.

Nous mènerons un essai d'alimentation randomisé, croisé, de type dose-réponse impliquant 16 adultes généralement en bonne santé (8 femmes, 8 hommes). L'essai consistera en 4 régimes prédéterminés, chacun durant 7 jours et séparés par une période de sevrage d'une semaine. Le 7e jour de chaque régime, les participants subiront un test de repas mixte à l'INAF pour recueillir des échantillons de plasma en état postprandial. Les 4 régimes seront basés sur un régime de fond sans produits laitiers reflétant une forte adhésion au guide alimentaire canadien, avec les ajouts suivants :

1. 125 g par 2 380 kcal par jour d'un pudding à base de soja (c'est-à-dire un régime sans yaourt) ;
2. 90 g par 2 380 kcal par jour de yaourt (c'est-à-dire 0,5 portion de référence de yaourt par 2 380 kcal par jour) ;
3. 175 g par 2 380 kcal par jour de yaourt (c'est-à-dire 1 portion de référence de yaourt par 2 380 kcal par jour) ;
4. 350 g par 2 380 kcal par jour de yaourt (c'est-à-dire 2 portions de référence par 2 380 kcal par jour).

Pour garantir que les biomarqueurs identifiés reflètent la diversité des yaourts, quatre variétés de yaourt seront testées :

a) yaourt nature régulier sans matière grasse ; b) yaourt nature régulier à 2 % de matière grasse laitière ; c) yaourt grec nature sans matière grasse ; d) yaourt grec nature à 2 % de matière grasse laitière. Chaque type de yaourt sera attribué à quatre participants, qui consommeront le même type de manière cohérente tout au long de l'étude. L'objectif n'est pas d'identifier un biomarqueur distinct pour chaque type de yaourt, mais de garantir que le(s) biomarqueur(s) identifié(s) tiennent compte de la diversité des types de yaourt. Pour l'intervention sans yaourt, tous les participants consommeront le même pudding à base de soja. Les participants réaliseront les quatre interventions de 7 jours dans un ordre aléatoire. Cette conception garantit que toute variation observée dans le métabolome plasmatique sera attribuée uniquement au yaourt.

Pendant les quatre interventions, tous les repas et aliments seront fournis à l'aide d'un menu cyclique de 7 jours, comme précédemment réalisé par notre équipe [28-30]. Le régime de fond pour chaque intervention sera identique, sans produits laitiers (c'est-à-dire excluant tous les produits laitiers et le beurre), et conçu pour refléter une forte adhésion au guide alimentaire canadien, avec un accent sur les aliments d'origine végétale peu transformés. Pour améliorer l'acceptabilité et l'adhésion, le menu inclura au moins une recette de la documentation officielle du guide alimentaire canadien chaque jour [31, 32]. Un technicien alimentaire expérimenté préparera les régimes, avec tous les aliments et ingrédients pesés avec précision au 0,1 g près. Dans le contexte de l'identification des biomarqueurs d'apport, le yaourt nature a été jugé le choix le plus approprié plutôt que le yaourt aromatisé. Cependant, le yaourt nature est moins savoureux en raison de son goût acide. Pour remédier à cela, le régime de fond inclura une portion quotidienne de petits fruits que les participants seront invités à mélanger au yaourt (ou au pudding de soja) ou à consommer à côté. Comme la portion de fruits sera standardisée et consommée en quantités constantes chaque jour au cours des quatre interventions, elle n'introduira pas de confusion dans le processus d'identification des biomarqueurs du yaourt. Nous considérons cette approche également favorable pour assurer la conformité pendant le régime contenant du pudding à base de soja.

À travers les quatre types de yaourt et les trois niveaux de consommation, le yaourt contribuera en moyenne à 120 kcal/jour, tout comme le pudding témoin à base de soja. La contribution calorique la plus faible sera de 40 kcal (yaourt nature régulier sans matière grasse, 90 g/jour), et la plus élevée de 240 kcal (yaourt grec nature à 2 % de matière grasse laitière ; 350 g/jour). Ces calories seront ajoutées à un régime de fond de 2 380 kcal/jour pour créer un menu standardisé qui atteindra en moyenne 2 500 kcal/jour sur les quatre interventions. Étant donné que les interventions ne durent que sept jours, il est peu probable que la différence dans la contribution calorique des yaourts ou du pudding à base de soja affecte le poids corporel ou introduise une confusion. L'approche proposée - ajouter les aliments testés à un régime de fond isoénergétique identique - est la stratégie optimale. Pour un participant unique, la seule différence entre les quatre régimes sera la teneur en yaourt, garantissant que toute différence post-régime dans le métabolome plasmatique est uniquement attribuable au yaourt. Inversement, si nous options pour maintenir une teneur calorique totale similaire du régime de fond à travers les quatre phases, des modifications du régime de fond seraient nécessaires, ce qui introduirait un biais dans le métabolome plasmatique. Au départ, les besoins énergétiques des participants seront estimés à l'aide d'équations prédictives validées [33], et la teneur énergétique totale des régimes sera ajustée en conséquence pour répondre à ces besoins.

Pendant chacune des quatre interventions de 7 jours, les participants devront consommer au moins trois repas complets à l'INAF sous la supervision du coordinateur de recherche clinique (CRC). Lors de ces visites, ils recevront également leurs repas pour les 24 à 72 heures suivantes. Les participants seront invités à ne consommer que les aliments fournis et à consommer tous les repas tels que fournis. L'alcool, les suppléments vitaminiques et les produits de santé naturels ne seront pas autorisés. Le thé et le café (≤2 tasses/jour) seront autorisés, sans fluctuations quotidiennes et sans lait, crème ou sucre. Une quantité illimitée d'eau sera autorisée. Les participants seront invités à maintenir leur niveau d'activité physique habituel stable pendant tout le protocole. Le 7e jour de chaque régime, les participants subiront un test de repas mixte aigu pour informer sur la réponse temporelle des biomarqueurs du yaourt. Après un jeûne de 12 heures, les participants arriveront à l'INAF à 7h30. Le repas test consistera en un smoothie de petit-déjeuner contenant le même yaourt (ou pudding à base de soja) fourni quotidiennement les jours précédents. Des échantillons de plasma seront recueillis au départ (à jeun) et 1, 2, 4 et 6 heures après le repas. Les échantillons seront prélevés dans des tubes EDTA et stockés à -80°C.

Pendant le test, les participants seront invités à remplir un rappel alimentaire de 24 heures autoadministré et validé en ligne (le R24W), spécifiquement validé pour la recherche auprès des adultes québécois [34-40]. La méthodologie complète et la validation derrière le R24W sont publiées [34-40]. Brièvement, le R24W guide les participants à indiquer tous les aliments et boissons, y compris l'alcool, consommés la veille. Le R24W permet de sélectionner les aliments et boissons consommés en parcourant une liste structurée d'aliments ou en utilisant un moteur de recherche. Il contient également des images standardisées pour aider à évaluer la taille des portions. Ces données seront utilisées pour comparer la performance du R24W avec celle des biomarqueurs du yaourt dans l'estimation de la teneur réelle en yaourt du régime.

Les participants et le CRC ne peuvent pas être aveuglés à l'attribution du régime. Cependant, la quantité exacte de yaourt (ou de pudding à base de soja) dans les régimes ne sera pas divulguée aux participants. Les quatre régimes seront étiquetés au hasard avec des lettres (par exemple, A = yaourt élevé, B = soja, C = yaourt faible, D = yaourt modéré). Cette approche minimisera le biais d'information pour la complétion du R24W à la fin de chaque intervention. Chaque intervention sera séparée par une période de sevrage d'une semaine, pour offrir aux participants une pause, réduisant le risque d'abandons associé à une intervention de plusieurs semaines. Pendant le sevrage, les participants seront invités à revenir à leur régime habituel. Nous n'anticipons aucun effet de report du régime pendant le sevrage sur les périodes d'intervention de 7 jours suivantes en ce qui concerne l'identification des biomarqueurs d'apport en yaourt. En effet, l'identification des biomarqueurs d'apport en yaourt s'appuiera sur les échantillons de plasma recueillis le septième jour de chaque intervention, à la fois à jeun et en état postprandial. Ainsi, il est très peu probable qu'un biomarqueur provenant d'aliments consommés pendant la période de sevrage présente la réponse postprandiale aiguë attendue pour le biomarqueur d'apport en yaourt selon la conception proposée [27]. La participation totale à l'essai sera de 7 semaines. À la fin de l'essai, pour chaque participant, nous aurons un total de 15 échantillons de plasma recueillis après consommation de yaourt (c'est-à-dire 5 échantillons × 3 niveaux de consommation de yaourt) et 5 échantillons recueillis après le régime sans yaourt, pour un total de 240 échantillons post-yaourt et 80 sans yaourt (total = 320).

Conformité et abandons anticipés : Une liste de contrôle sera fournie pour suivre la consommation alimentaire quotidienne. Avoir 3 repas complets consommés à l'INAF sous la supervision du CRC renforcera l'adhésion au protocole. Dans nos études précédentes avec des conceptions similaires, 99 % des aliments fournis ont été consommés [28, 29], avec seulement des écarts anecdotiques, tous autodéclarés. Le professeur Drouin-Chartier a initialement développé et utilisé le même menu de 7 jours dans un ECR entièrement alimenté financé par les IRSC auprès de 50 adultes atteints d'hypercholestérolémie familiale hétérozygote, avec des interventions durant 4 semaines. La conformité était > 99 % et le régime était très apprécié, sans différences entre les participants féminins et masculins. Nous avons précédemment mené des ECR d'alimentation entièrement contrôlés de durée plus longue (par exemple, 5 × 4 semaines ou 3 × 6 semaines) avec des procédures plus invasives (par exemple, biopsies intestinales) et des régimes moins typiques des habitudes canadiennes (par exemple, méditerranéen, sans produits laitiers), mais les taux d'abandon n'ont jamais dépassé 20 % [28, 29, 41]. Les périodes de sevrage réduisent le risque d'abandon. Nous n'anticipons aucun problème de conformité. Nous avons prévu d'inclure 20 participants, en attendant qu'au moins 16 complètent le protocole complet.

Procédures de recrutement : Critères d'inclusion : âge : 18-70 ans ; IMC : 18-40 kg/m² ; volonté de consommer du yaourt nature quotidiennement pendant 3 semaines ; pour les consommateurs de café/thé, volonté de consommer ces boissons sans lait, crème ou sucre ajoutés pendant 4 semaines. Critères d'exclusion : intolérance au lactose ; don de sang dans les 2 mois ; maladie chronique grave ou traitement en cours pour des affections telles que infections, maladies auto-immunes, cancer, diabète de type 2, maladie de Crohn, maladie cœliaque, maladies hépatiques ou rénales ; antécédents de cancer grave, maladie cardiovasculaire ou chirurgie bariatrique ; poids corporel instable depuis 3 mois ; consommation de drogues illicites ou alcoolisme ; tabagisme/vapotage de cannabis (garantir l'absence de fluctuations quotidiennes et un signalement objectif de la consommation est trop complexe) ; allergies ou aversions aux composants des régimes. Les participants seront recrutés dans la région de Québec par des courriels de masse de l'INAF (portée : > 5 000) et de l'Université Laval (> 20 000). Les personnes intéressées seront invitées à contacter le CRC pour un appel téléphonique de sélection. Les personnes éligibles seront ensuite invitées à une séance d'information en personne, où les détails complets du protocole seront expliqués. Les personnes intéressées seront invitées à fournir un consentement éclairé. Ensuite, les participants seront randomisés, et une visite de base sera planifiée. Un total de 10 séquences de randomisation différentes seront générées à l'aide de la conception de Williams pour garantir que chaque traitement suit chaque autre traitement un nombre égal de fois. Chaque séquence sera attribuée à un seul participant, de manière spécifique au sexe. Nous anticipons que l'essai nécessitera 20 semaines pour être complété. L'INAF abrite la plus grande unité de recherche en nutrition clinique du Canada (800 m²), et l'une des rares installations du pays capable de mener des ECR entièrement contrôlés. Il dispose d'une cuisine métabolique, d'une cafétéria, d'espaces pour la collecte d'échantillons biologiques, d'une plateforme électronique pour l'évaluation alimentaire, la randomisation et la gestion des participants, et d'une plateforme de métabolomique. Une infirmière de recherche à temps plein est en poste. Le centre de données de l'ULaval assure un stockage sécurisé et une capacité analytique. Cette infrastructure de pointe est essentielle au succès du projet.

Profilage métabolomique : Une fois l'essai terminé, les échantillons de plasma seront traités à la plateforme de métabolomique de l'INAF en utilisant quatre méthodes LC complémentaires (ionisation par électrospray positive et négative) pour déterminer l'abondance relative d'environ 22 000 métabolites. Ceux-ci incluent les acides aminés, les sucres et les petits acides organiques (BEH Amide) ; les métabolites de polyphénols et les petits peptides (HSS T3) ; les acides gras libres et les acides biliaires (CSH C18) ; et les lipides (BEH C8). En plus des échantillons de plasma, nous traiterons également des échantillons de chacun des 4 yaourts et du pudding de soja. Le profilage métabolomique sera réalisé en utilisant un Thermo Vanquish U-HPLC couplé à un spectromètre de masse Thermo Fusion Tribrid Orbitrap ou un Waters Acquity I-Class UPLC couplé à un Waters Synapt G2-Si, selon la méthode. Les données brutes seront traitées à l'aide de Compound Discoverer et Progenesis QI. L'identification des métabolites sera effectuée en utilisant la banque de standards analytiques en constante croissance de l'INAF (n = 1 000 composés, par exemple, acides aminés, métabolites d'origine intestinale, acides biliaires, composés phénoliques, acides gras). Des pics chromatographiques supplémentaires d'intérêt subiront une identification putative en utilisant plusieurs bases de données spectrales et moléculaires (par exemple, mzCloud, HMDB). Le profilage métabolomique devrait prendre 1 mois.

Analyses statistiques : Étape 1 : identification des biomarqueurs potentiels de consommation de yaourt. Pour ce faire, nous visons à identifier tous les métabolites permettant de distinguer un régime contenant du yaourt d'un régime sans yaourt. Les variables indépendantes incluront l'abondance relative de tous les métabolites (n = 22 000) mesurés après chacune des quatre interventions, considérant les échantillons de plasma pour chaque participant du présent essai (320 observations, dont 80 sans yaourt), et de notre précédente étude sur les biomarqueurs du lait et du fromage (n = 284 échantillons de plasma sans yaourt, traités en utilisant les mêmes méthodes métabolomiques ; total = 604). La variable dépendante sera « présence de yaourt dans le régime » (oui/non). Nous utiliserons l'algorithme de boosting de gradient extrême (XGBoost) pour entraîner des modèles de classification [42]. Un processus itératif sera répété n fois : (1) entraîner les modèles, (2) identifier le métabolite avec la meilleure capacité prédictive, calculée par test de permutation, et (3) retirer ce métabolite avant l'itération suivante. Pour chaque itération, 25 modèles seront entraînés en utilisant différentes répartitions des participants en ensembles d'entraînement (80 % ; n = 484 observations) et de test (20 % ; n = 120). Les itérations continueront jusqu'à ce que l'intervalle de confiance à 95 % de la sensibilité ou de la spécificité des modèles atteigne 0,5 (puissance prédictive nulle d'un algorithme de classification). À la fin de cette étape, les n métabolites retirés constitueront le pool de biomarqueurs potentiels de consommation de yaourt, qui seront retenus pour les étapes suivantes. Les étapes suivantes exploiteront des approches statistiques standard pour tester les caractéristiques clés d'un biomarqueur validé de consommation alimentaire, tel que proposé par FoodBALL. Sauf indication contraire, tous les tests suivants seront réalisés en utilisant des modèles mixtes pour mesures répétées, avec l'abondance relative des métabolites comme variable dépendante. Les modèles seront ajustés pour l'âge, le sexe, l'indice de masse corporelle et les calories totales quotidiennes du régime.

Étape 2, réponse dose brute : Nous comparerons l'abondance relative de chaque biomarqueur potentiel suivant les régimes sans yaourt et contenant du yaourt. Seuls les métabolites dont l'abondance augmente avec la consommation de yaourt passeront à l'étape suivante.

Étape 3, réponse dose raffinée : Nous comparerons l'abondance relative des métabolites à travers les trois niveaux de consommation de yaourt testés dans l'étude. Les métabolites montrant une tendance linéaire significative, avec le régime sans yaourt codé comme 0, seront retenus.

Étape 4, réponse temporelle : En utilisant les données des échantillons de plasma recueillis pendant le repas test aigu, nous évaluerons si l'abondance relative des métabolites augmente au fil du temps. Les métabolites avec une plus grande aire sous la courbe (AUC) après consommation de yaourt comparé au pudding à base de soja seront retenus.

Étape 5, spécificité : Pour confirmer la spécificité au yaourt, les métabolites doivent montrer une abondance accrue avec le yaourt mais pas avec le lait ou le fromage. Pour tester cela, nous utiliserons les données métabolomiques générées à partir de la subvention DFC précédente détenue par le professeur Drouin-Chartier. Dans ce projet précédent, des échantillons de plasma recueillis à partir de 4 ECR croisés précédemment menés avec des paramètres d'alimentation entièrement contrôlés visant à évaluer l'impact de la consommation de lait ou de fromage sur 4 à 6 semaines sur les facteurs de risque cardiométabolique ont été utilisés pour identifier des biomarqueurs métabolites de consommation de lait et de fromage, séparément. Cet ensemble de données comprend des données métabolomiques de régimes entièrement contrôlés contenant du lait ou du fromage et un régime sans produits laitiers pour 118 individus. Les métabolites dont l'abondance n'est pas augmentée par le lait ou le fromage seront retenus à la fin de cette étape. Cela sera réalisé sans coût supplémentaire.

Étape 6, robustesse : Nous utiliserons également les données métabolomiques générées dans notre subvention DFC passée. Celles-ci proviendront d'une cohorte transversale de 200 adultes qui ont fourni un échantillon de plasma à jeun et complété trois rappels alimentaires de 24 heures (R24W) la semaine précédant l'échantillonnage plasmatique, dont un rapportant leurs apports alimentaires la veille de l'échantillonnage plasmatique. Les participants seront divisés par la consommation médiane de yaourt. Seuls les métabolites avec une abondance plus grande chez les participants au-dessus de la médiane seront retenus. Cette étape n'engendrera également aucun coût supplémentaire.

Étape 7, plausibilité : Nous évaluerons la plausibilité des métabolites retenus comme provenant du yaourt en fonction de leur nature et de leurs structures chimiques, en utilisant la base de données sur la composition du lait. De plus, nous comparerons ces métabolites aux profils métabolomiques des quatre yaourts testés. Après cette étape, les métabolites retenus auront déjà satisfait aux critères essentiels de FoodBALL pour être considérés comme des biomarqueurs validés de consommation de yaourt. Compte tenu des caractéristiques matricielles uniques du yaourt, nous sommes confiants d'identifier au moins un métabolite répondant à tous les critères. Dans nos travaux précédents, nous avons identifié avec succès un biomarqueur pour la consommation de lait (la delta-valérobétaïne, un composant spécifique au lait) et neuf autres différents pour la consommation de fromage.

Évaluation de la performance : Nous entraînerons d'abord un modèle pour estimer la consommation de yaourt en utilisant les biomarqueurs identifiés en croisant leur abondance relative avec les niveaux de consommation de yaourt connus fournis aux participants pendant l'essai. Cela sera fait en utilisant l'algorithme Multimarker [43], qui a été spécifiquement développé pour modéliser la consommation alimentaire basée sur des biomarqueurs [44]. Le modèle générera une équation d'étalonnage que nous utiliserons pour étalonner les données de rappel alimentaire de 24 heures et produire des estimations calibrées par biomarqueurs de la consommation de yaourt. Ensuite, nous évaluerons la précision des estimations de consommation de yaourt obtenues en utilisant : a) l'équation d'étalonnage (biomarqueurs seuls), b) le rappel alimentaire de 24 heures calibré (biomarqueurs × apport autodéclaré), et c) le rappel alimentaire de 24 heures non calibré (apport autodéclaré seul), en comparant chacune à l'apport réel fourni dans les menus de l'étude. Nous comparerons les coefficients de corrélation de Pearson et leurs intervalles de confiance à 95 % à travers les méthodes en utilisant des tests t.