Identifikation af objektive metabolomics-baserede biomarkører for yoghurtforbrug (YOGBIO)

Den amerikanske fødevare- og lægemiddelstyrelse (FDA) har for nylig vurderet, at de videnskabelige beviser er tilstrækkeligt robuste til at godkende en ansøgning om et kvalificeret sundhedsclaim for yoghurt og reduceret risiko for type 2-diabetes (T2D).
Derimod har Health Canada endnu ikke godkendt et lignende claim.
De eksisterende beviser stammer udelukkende fra prospektive kohortestudier, der er baseret på selvrapporterede kostspørgeskemaer, som – på trods af at være valideret – er underlagt tilfældige og systematiske fejl, der kan kompromittere beviskvaliteten og hindre regulatorisk godkendelse.

Biomarkører for fødevareindtag anerkendes i stigende grad som værdifulde værktøjer til at øge objektiviteten i ernæringsepidemiologi.
Metabolomik, den omfattende profilering af plasmametabolitter, betragtes som guldstandarden for at identificere sådanne biomarkører.
I mælkekonteksten var et større milepæl identifikationen af et metabolomisk signatur for yoghurtindtag i en stor spansk kohorte.
Dette signatur – bestående af 27 metabolitter (f.eks. C14:0 sfingomyelin, der stammer fra myristinsyre) – var prædiktivt for yoghurtindtag i en uafhængig amerikansk kohorte og associeret med lavere T2D-incidens i begge populationer.
Men fordi dette signatur blev afledt fra observationsdata, manglede det specifikitet for yoghurtindtag.

Dette projekt søger at udfylde dette kritiske hul ved at opdage specifikke biomarkører for yoghurtindtag og validere dem mod anerkendte kriterier.

Vi vil gennemføre et randomiseret, crossover, dosis-respons fodringsstudie med 16 generelt sunde voksne (8 kvinder, 8 mænd).
Studiet vil bestå af 4 forudbestemte diæter, hver på 7 dage og adskilt af en 1-ugers udvaskningsperiode.
På den 7. dag af hver diæt vil deltagerne gennemgå en blandet-måltidstest på INAF for at indsamle plasmaprøver i postprandial tilstand.
De 4 diæter vil være baseret på en mælkefri baggrundsdiæt, der afspejler høj overholdelse af Canadas kostvejledning, med følgende tilføjelser:

1. 125 g pr. 2.380 kcal pr. dag af en sojabaseret budding (dvs. yoghurtfri diæt);
2. 90 g pr. 2.380 kcal pr. dag af yoghurt (dvs. 0,5 referenceserving yoghurt pr. 2.380 kcal pr. dag);
3. 175 g pr. 2.380 kcal pr. dag af yoghurt (dvs. 1 referenceserving yoghurt pr. 2.380 kcal pr. dag);
4. 350 g pr. 2.380 kcal pr. dag af yoghurt (dvs. 2 referenceservinger pr. 2.380 kcal pr. dag).

For at sikre, at de identificerede biomarkører afspejler yoghurtens diversitet, vil fire yoghurtvarianter blive testet:

a) fedtfri almindelig naturlig yoghurt; b) 2% mælkefedt almindelig naturlig yoghurt; c) fedtfri naturlig græsk yoghurt; d) 2% mælkefedt naturlig græsk yoghurt.
Hver yoghurttype vil blive tildelt fire deltagere, som vil indtage den samme type konsekvent gennem hele studiet.
Målet er ikke at identificere en distinkt biomarkør for hver yoghurttype, men at sikre, at den identificerede biomarkør(er) tager højde for diversiteten af yoghurttyper.
For den yoghurtfri intervention vil alle deltagere indtage den samme sojabaseret budding.
Deltagerne vil gennemføre de fire 7-dages interventioner i tilfældig rækkefølge.
Dette design sikrer, at eventuelle observerede variationer i plasma-metabolomet udelukkende kan tilskrives yoghurt.

Under alle fire interventioner vil alle måltider og fødevarer blive leveret ved hjælp af en 7-dages cyklisk menu, som tidligere gjort af vores team [28-30].
Baggrundsdiæten for hver intervention vil være identisk, mælkefri (dvs. ekskluderer alle mejeriprodukter og smør) og designet til at afspejle høj overholdelse af Canadas kostvejledning, med vægt på minimalt forarbejdede plantebaserede fødevarer.
For at forbedre acceptabilitet og overholdelse vil menuen inkludere mindst én opskrift fra den officielle Canadas kostvejledningsdokumentation hver dag [31, 32].
En erfaren fødevaretekniker vil tilberede diæterne, med alle fødevarer og ingredienser præcist vejet til nærmeste 0,1 g.
I forbindelse med identifikation af indtagsbiomarkører blev naturlig yoghurt anset for det mest passende valg i stedet for aromatiseret yoghurt.
Dog er naturlig yoghurt mindre velsmagende på grund af dens sure smag.
For at løse dette vil baggrundsdiæten inkludere en daglig portion små frugter, som deltagerne vil blive instrueret i enten at blande ind i yoghurten (eller sojabuddingen) eller indtage sammen med.
Da frugtportionen vil blive standardiseret og indtaget i konsistente mængder hver dag på tværs af de fire interventioner, vil den ikke introducere forvirrende faktorer i yoghurt-biomarkør-identifikationsprocessen.
Vi betragter denne tilgang også som fordelagtig for at sikre compliance under diæten med sojabaseret budding.

På tværs af de fire yoghurttyper og tre indtagsniveauer vil yoghurt bidrage med i gennemsnit 120 kcal/dag, ligesom kontrol-sojabuddingen vil.
Det laveste kaloriebidrag vil være 40 kcal (fedtfri almindelig naturlig yoghurt, 90 g/dag), og det højeste vil være 240 kcal (2% mælkefedt naturlig græsk yoghurt; 350 g/dag).
Disse kalorier vil blive tilføjet til en 2.380 kcal/dag baggrundsdiæt for at skabe en standardiseret menu, der i gennemsnit vil beløbe sig til 2.500 kcal/dag på tværs af de fire interventioner.
Da interventionerne kun varer syv dage, er det usandsynligt, at forskellen i kaloriebidraget fra yoghurterne eller sojabuddingen vil påvirke kropsvægten eller introducere forvirrende faktorer.
Den foreslåede tilgang – at tilføje de testede fødevarer til en identisk isoenergetisk baggrundsdiæt – er den optimale strategi.
For en enkelt deltager vil den eneste forskel mellem de fire diæter være yoghurtindholdet, hvilket sikrer, at eventuelle efter-diæt-forskelle i plasma-metabolomet udelukkende kan tilskrives yoghurt.
Omvendt, hvis vi valgte at opretholde et lignende totalt kalorieindhold af baggrundsdiæten på tværs af de fire faser, ville ændringer til baggrundsdiæten være nødvendige, hvilket ville introducere bias i plasma-metabolomet.
Ved baseline vil deltagernes energibehov blive estimeret ved hjælp af validerede prædiktive ligninger [33], og diæternes totale energiindhold vil blive justeret i overensstemmelse hermed for at opfylde disse behov.

Under hver af de fire 7-dages interventioner vil deltagerne være forpligtet til at indtage mindst tre fulde måltider på INAF under klinisk forskningskoordinator (CRC)'s tilsyn.
Under disse besøg vil de også modtage deres måltider for de næste 24 til 72 timer.
Deltagerne vil blive instrueret i kun at indtage de leverede fødevarer og at indtage alle måltider som leveret.
Alkohol, vitamin tilskud og naturlige helseprodukter vil ikke være tilladt.
The og kaffe (≤2 kopper/dag) vil være tilladt, uden daglige udsving og uden mælk, fløde eller sukker.
Ubegrænset mængde vand vil være tilladt.
Deltagerne vil blive instrueret i at opretholde deres sædvanlige fysiske aktivitetsniveau stabilt gennem hele protokollen.
På den 7. dag af hver diæt vil deltagerne gennemgå en akut blandet-måltidstest for at informere om tidsresponsivitet af yoghurt-biomarkørerne.
Efter en 12-timers faste vil deltagerne ankomme til INAF kl. 7:30.
Testmåltidet vil bestå af en morgenmadssmoothie indeholdende den samme yoghurt (eller sojabaseret budding) leveret dagligt i de foregående dage.
Plasmaprøver vil blive indsamlet ved baseline (fastende) og 1, 2, 4 og 6 timer efter måltidet.
Prøver vil blive taget i EDTA-rør og opbevaret ved -80°C.

Under testen vil deltagerne blive instrueret i at udfylde et valideret selvadministreret webbaseret 24-timers kostrecall (R24W), specifikt valideret til forskning blandt voksne i Quebec [34-40].
Den fulde metodologi og validering bag R24W er offentliggjort [34-40].
Kort fortalt guidere R24W deltagerne til at angive alle fødevarer og drikkevarer, inklusive alkohol, indtaget den foregående dag.
R24W tillader valg af fødevarer og drikkevarer indtaget ved at gennemgå en struktureret liste over fødevarer eller ved at bruge en søgemaskine.
Den indeholder også standardiserede billeder til at hjælpe med at vurdere portionsstørrelser.
Disse data vil blive brugt til at sammenligne R24W's præstation med yoghurt-biomarkørernes i estimering af diætens sande yoghurtindhold.

Deltagere og CRC kan ikke være blindede for diættildeling.
Dog vil den nøjagtige mængde yoghurt (eller sojabaseret budding) i diæterne ikke blive afsløret for deltagerne.
De fire diæter vil blive tilfældigt mærket med bogstaver (f.eks. A=høj yoghurt, B=soja, C=lav yoghurt, D=moderat yoghurt).
Denne tilgang vil minimere informationsbias for udfyldelsen af R24W ved afslutningen af hver intervention.
Hver intervention vil blive adskilt af en 1-ugers udvaskningsperiode for at give deltagerne en pause, hvilket reducerer risikoen for frafald forbundet med en flerugers intervention.
Under udvaskningen vil deltagerne blive instrueret i at vende tilbage til deres sædvanlige diæt.
Vi forventer ikke nogen carryover-effekter af diæten under udvaskningen på de efterfølgende 7-dages interventionsperioder med hensyn til yoghurtindtagsbiomarkør-identifikation.
Faktisk vil identifikation af yoghurtindtagsbiomarkør udnytte plasmaprøverne indsamlet på dag syv af hver intervention, både i fastende og postprandial tilstand.
Således er det højst usandsynligt, at en biomarkør fra fødevarer indtaget under udvaskningsperioden udviser den akutte postprandiale responsivitet forventet for yoghurtindtagsbiomarkør under det foreslåede design [27].
Samlet studiedeltagelse vil være 7 uger.
Ved studiet afslutning vil vi for hver deltager have i alt 15 plasmaprøver indsamlet efter yoghurtindtag (dvs. 5 prøver x 3 niveauer af yoghurtindtag) og 5 prøver indsamlet efter den yoghurtfri diæt, for i alt 240 efter-yoghurt prøver og 80 uden yoghurt (total=320).

Compliance og forventede frafald: En tjekliste vil blive leveret for at spore dagligt fødevareindtag.
At have 3 fulde måltider indtaget på INAF under CRC's tilsyn vil forstærke overholdelse af protokollen.
I vores tidligere studier med lignende designs blev 99% af de leverede fødevarer indtaget [28, 29], med kun anekdotiske afvigelser, alle selvrapporterede.
Prof. Drouin-Chartier udviklede oprindeligt og brugte den samme 7-dages menu i et CIHR-finansieret fuldt fodret RCT med 50 voksne med heterozygot familiær hyperkolesterolemi, med interventioner på 4 uger.
Compliance var >99% og diæten var højt værdsat, uden forskelle mellem kvindelige og mandlige deltagere.
Vi har tidligere gennemført fuldt kontrollerede fodrings-RCT'er af længere varighed (f.eks. 5×4 uger eller 3×6 uger) med mere invasive procedurer (f.eks. tarmbiopsier) og diæter mindre typiske for canadiske vaner (f.eks. middelhavs-, mælkefri), men frafaldrater oversteg aldrig 20% [28, 29, 41].
Udvaskningsperioderne reducerer frafaldsrisiko.
Vi forventer ingen compliance-problemer.
Vi planlagde at rekruttere 20 deltagere, forventende at mindst 16 gennemfører den fulde protokol.

Rekrutteringsprocedurer: Inklusionskriterier: alder: 18-70 år; BMI: 18-40 kg/m²; villighed til at indtage naturlig yoghurt dagligt i 3 uger; for kaffe/the-forbrugere, villighed til at indtage disse drikkevarer uden tilsat mælk, fløde eller sukker i 4 uger.
Eksklusionskriterier: laktoseintolerans; bloddonation inden for 2 måneder; svær kronisk sygdom eller igangværende behandling for tilstande som infektioner, autoimmunsygdomme, kræft, type 2-diabetes, Crohns sygdom, cøliaki, leversygdomme eller nyresygdomme; historie med svær kræft, hjerte-kar-sygdom eller bariatrisk kirurgi; ustabil kropsvægt i 3 måneder; ulovligt stofmisbrug eller alkoholisme; tobak/cannabis rygning/dampning (sikring af ingen dag-til-dag udsving og objektiv rapportering af forbrug er for komplekst); allergier eller aversioner mod komponenter i diæterne.
Deltagere vil blive rekrutteret fra Quebec City-området gennem masse-e-mails fra INAF (rækkevidde: >5.000) og Université Laval (>20.000).
Interesserede individer vil blive inviteret til at kontakte CRC for et screeningsopkald.
Kvalificerede individer vil derefter blive inviteret til en personlig informationssession, hvor alle detaljer i protokollen vil blive forklaret.
Interesserede vil blive bedt om at give informeret samtykke.
Derefter vil deltagere blive randomiseret, og et baseline-besøg vil blive planlagt.
I alt 10 forskellige randomiseringssekvenser vil blive genereret ved hjælp af Williams design for at sikre, at hver behandling følger hver anden behandling et lige antal gange.
Hver sekvens vil blive tildelt en enkelt deltager på en køns-specifik måde.
Vi forventer, at studiet vil kræve 20 uger at gennemføre.
INAF er hjemsted for Canadas største kliniske ernæringsforskningsenhed (800 m²) og en af de få faciliteter i landet i stand til fuldt kontrollerede RCT'er.
Den indeholder et metabolisk køkken, cafeteria, rum til indsamling af biologiske prøver, en e-platform til kostvurdering, deltagerrandomisering og -administration og en metabolomik-platform.
En fuldtids forskningssygeplejerske er på personale.
ULavals datacenter sikrer sikker opbevaring og analytisk kapacitet.
Denne state-of-the-art infrastruktur er nøglen til projektets succes.

Metabolomik profilering: Når studiet er afsluttet, vil plasmaprøver blive behandlet på INAF metabolomik-platform ved hjælp af fire komplementære LC-metoder (positiv og negativ electrospray ionisering) for at bestemme den relative overflod af ~22.000 metabolitter.
Disse inkluderer aminosyrer, sukkerarter og små organiske syrer (BEH Amide); polyphenol metabolitter og små peptider (HSS T3); frie fedtsyrer og galdesyrer (CSH C18); og lipider (BEH C8).
Udover plasmaprøver vil vi også behandle prøver af hver af de 4 yoghurter og sojabuddingen.
Metabolomik profilering vil blive udført ved hjælp af en Thermo Vanquish U-HPLC koblet til en Thermo Fusion Tribrid Orbitrap massespektrometer eller en Waters Acquity I-Class UPLC koblet til en Waters Synapt G2-Si, afhængigt af metoden.
Rådata vil blive behandlet ved hjælp af Compound Discoverer og Progenesis QI.
Metabolitidentifikation vil blive udført ved hjælp af den stadigt voksende INAF analytiske standardbank (n=1.000 forbindelser, f.eks. aminosyrer, tarm-afledte metabolitter, galdesyrer, fenoliske forbindelser, fedtsyrer).
Yderligere kromatografiske toppe af interesse vil gennemgå putativ identifikation ved hjælp af flere spektrale og molekylære databaser (f.eks. mzCloud, HMDB).
Metabolomik profilering forventes at tage 1 måned.

Statistiske analyser: Trin 1: identifikation af potentielle biomarkører for yoghurtindtag.
For at gøre dette sigter vi mod at identificere alle metabolitter, der gør det muligt at skelne mellem en yoghurtindholdende og en yoghurtfri diæt.
Uafhængige variable vil inkludere den relative overflod af alle metabolitter (n=22.000) målt efter hver af de fire interventioner, under hensyntagen til plasmaprøver for hver deltager fra det nuværende studie (320 observationer, hvoraf 80 er yoghurtfri), og fra vores tidligere mælk- og ost-biomarkørstudie (n=284 yoghurtfri plasmaprøver, behandlet ved hjælp af de samme metabolomik-metoder; total=604).
Den afhængige variabel vil være "tilstedeværelse af yoghurt i diæten" (ja/nej).
Vi vil bruge extreme gradient boosting algoritmen (XGBoost) til at træne klassifikationsmodeller [42].
En iterativ proces vil blive gentaget n gange: (1) træning af modellerne, (2) identifikation af metaboliten med den bedste prædiktive evne, beregnet ved permutationstestning, og (3) fjernelse af denne metabolit før næste iteration.
For hver iteration vil 25 modeller blive trænet ved hjælp af forskellige opdelinger af deltagere i trænings- (80%; n=484 observationer) og test- (20%; n=120) sæt.
Iterationerne vil fortsætte, indtil følsomhed eller specificitet 95% konfidensinterval for modellerne når 0,5 (null prædiktiv kraft af en klassifikationsalgoritme).
Ved afslutningen af dette trin vil de n fjernede metabolitter udgøre puljen af potentielle biomarkører for yoghurtindtag, som vil blive bevaret til efterfølgende trin.
De efterfølgende trin vil udnytte standard statistiske tilgange til at teste nøgleegenskaberne for en valideret biomarkør for fødevareindtag, som foreslået af FoodBALL.
Medmindre andet er angivet, vil alle følgende tests blive udført ved hjælp af blandede modeller for gentagne målinger, med metabolit relativ overflod som den afhængige variabel.
Modellerne vil blive justeret for alder, køn, body mass index og samlede daglige kalorier fra diæten.

Trin 2, grov dosis-responsivitet: Vi vil sammenligne den relative overflod af hver potentiel biomarkør efter yoghurtfri og yoghurtindholdende diæter.
Kun metabolitter, hvis overflod stiger med yoghurtindtag, vil fortsætte til næste trin.

Trin 3, raffineret dosis-responsivitet: Vi vil sammenligne den relative overflod af metabolitter på tværs af de tre niveauer af yoghurtindtag testet i studiet.
Metabolitter, der viser en signifikant lineær trend, med den yoghurtfri diæt kodet som 0, vil blive bevaret.

Trin 4, tids-responsivitet: Ved hjælp af data fra plasmaprøver indsamlet under det akutte testmåltid vil vi vurdere, om den relative overflod af metabolitter stiger over tid.
Metabolitter med et større areal under kurven (AUC) efter yoghurtindtag sammenlignet med sojabuddingen vil blive bevaret.

Trin 5, specificitet: For at bekræfte specificitet for yoghurt skal metabolitter vise øget overflod med yoghurt, men ikke med mælk eller ost.
For at teste dette vil vi bruge metabolomik-data genereret fra det tidligere DFC-stipendium holdt af Prof. Drouin-Chartier.
I dette tidligere projekt blev plasmaprøver indsamlet fra 4 tidligere gennemførte crossover RCT'er med fulde fodringsindstillinger, der sigtede mod at evaluere indvirkningen af mælk- eller ostindtag over 4 til 6 uger på kardiometabole risikofaktorer, brugt til at identificere metabolit-biomarkører for mælk- og ostindtag hver for sig.
Dette datasæt omfatter metabolomik-data fra fuldt kontrollerede mælk- eller ostindholdende diæter og en mælkefri diæt for 118 individer.
Metabolitter, hvis overflod ikke øges af mælk eller ost, vil blive bevaret ved afslutningen af dette trin.
Dette vil blive udført uden ekstra omkostninger.

Trin 6, robusthed: Vi vil også bruge metabolomik-data genereret i vores tidligere DFC-stipendium.
Disse vil komme fra en tværsnitskohorte på 200 voksne, der leverede en fastende plasmaprøve og udfyldte tre 24-timers kostrecall (R24W) i ugen forud for plasmaudtagning, inklusive en rapportering om deres kostindtag dagen før plasmaudtagningen.
Deltagere vil blive opdelt ved median yoghurtindtag.
Kun metabolitter med større overflod i deltagere over medianen vil blive bevaret.
Dette trin vil også medføre ingen ekstra omkostninger.

Trin 7, plausibilitet: Vi vil vurdere plausibiliteten af de bevarede metabolitter som stammer fra yoghurt baseret på deres natur og kemiske strukturer ved hjælp af Milk Composition Database.
Derudover vil vi sammenligne disse metabolitter med metabolomik-profilerne af de fire testede yoghurter.
Efter dette trin vil de bevarede metabolitter allerede have opfyldt FoodBALL's essentielle kriterier for at blive betragtet som validerede biomarkører for yoghurtindtag.
Givet yoghurtens unikke matrixegenskaber er vi sikre på at identificere mindst en metabolit, der opfylder alle kriterier.
I vores tidligere arbejde identificerede vi med succes én biomarkør for mælkindtag (delta-valerobetain, en mælk-specifik komponent) og ni forskellige andre for ostindtag.

Præstationsevaluering: Vi vil først træne en model til at estimere yoghurtindtag ved hjælp af de identificerede biomarkører ved at krydsreferere deres relative overflod med de kendte yoghurtindtagsniveauer leveret til deltagere under studiet.
Dette vil blive gjort ved hjælp af Multimarker-algoritmen [43], som specifikt blev udviklet til at modellere fødevareindtag baseret på biomarkører [44].
Modellen vil generere en kalibreringsligning, som vi vil bruge til at kalibrere 24-timers kostrecall-data og producere biomarkør-kalibrerede estimater af yoghurtindtag.
Derefter vil vi evaluere nøjagtigheden af yoghurtindtagsestimater opnået ved hjælp af: a) kalibreringsligningen (biomarkører alene), b) det kalibrerede 24-timers kostrecall (biomarkører × selvrapporteret indtag), og c) det ikke-kalibrerede 24-timers kostrecall (selvrapporteret indtag alene), ved at sammenligne hver med det sande indtag leveret i studiemenuerne.
Vi vil sammenligne Pearson korrelationskoefficienter og deres 95% konfidensintervaller på tværs af metoder ved hjælp af t-tests.