Identificazione di biomarcatori oggettivi basati sulla metabolomica del consumo di yogurt (YOGBIO)

La Food and Drug Administration statunitense ha recentemente ritenuto le prove scientifiche sufficientemente solide da approvare una petizione per una dichiarazione di salute qualificata sullo yogurt e la riduzione del rischio di diabete di tipo 2 (T2D). Al contrario, Health Canada non ha ancora approvato una dichiarazione simile. Le prove esistenti derivano esclusivamente da studi prospettici di coorte basati su questionari dietetici auto-riferiti, che - nonostante siano validati - sono soggetti a errori casuali e sistematici che possono compromettere la qualità delle prove e ostacolare l'approvazione normativa.

I biomarcatori di assunzione alimentare sono sempre più riconosciuti come strumenti preziosi per migliorare l'oggettività nell'epidemiologia nutrizionale. La metabolomica, il profilo completo dei metaboliti plasmatici, è considerata lo standard di riferimento per identificare tali biomarcatori. Nel contesto dei latticini, una pietra miliare significativa è stata l'identificazione di una firma metabolomica dell'assunzione di yogurt in una vasta coorte spagnola. Questa firma - composta da 27 metaboliti (ad esempio, C14:0 sfingomielina, derivata dall'acido miristico) - era predittiva dell'assunzione di yogurt in una coorte statunitense indipendente e associata a una minore incidenza di T2D in entrambe le popolazioni. Tuttavia, poiché questa firma è stata derivata da dati osservazionali, mancava di specificità per l'assunzione di yogurt.

Questo progetto mira a colmare questa lacuna critica scoprendo biomarcatori specifici dell'assunzione di yogurt e validandoli secondo criteri riconosciuti.

Condurremo uno studio di alimentazione randomizzato, crossover, dose-risposta che coinvolge 16 adulti generalmente sani (8 femmine, 8 maschi). Lo studio consisterà in 4 diete predeterminate, ciascuna della durata di 7 giorni e separate da un periodo di washout di 1 settimana. Il 7° giorno di ciascuna dieta, i partecipanti si sottoporranno a un test di pasto misto presso l'INAF per raccogliere campioni di plasma in stato postprandiale. Le 4 diete saranno basate su una dieta di fondo priva di latticini che riflette un'elevata aderenza alla guida alimentare canadese, con le seguenti aggiunte:

1. 125 g per 2.380 kcal al giorno di un budino a base di soia (cioè dieta priva di yogurt);
2. 90 g per 2.380 kcal al giorno di yogurt (cioè 0,5 porzione di riferimento di yogurt per 2.380 kcal al giorno);
3. 175 g per 2.380 kcal al giorno di yogurt (cioè 1 porzione di riferimento di yogurt per 2.380 kcal al giorno);
4. 350 g per 2.380 kcal al giorno di yogurt (cioè 2 porzioni di riferimento per 2.380 kcal al giorno).

Per garantire che i biomarcatori identificati riflettano la diversità degli yogurt, verranno testate quattro varietà di yogurt:

a) yogurt normale magro naturale; b) yogurt normale naturale con il 2% di grasso del latte; c) yogurt greco magro naturale; d) yogurt greco naturale con il 2% di grasso del latte. Ogni tipo di yogurt sarà assegnato a quattro partecipanti, che consumeranno costantemente lo stesso tipo per tutta la durata dello studio. L'obiettivo non è identificare un biomarcatore distinto per ogni tipo di yogurt, ma garantire che il/i biomarcatore/i identificato/i tengano conto della diversità dei tipi di yogurt. Per l'intervento privo di yogurt, tutti i partecipanti consumeranno lo stesso budino a base di soia. I partecipanti completeranno i quattro interventi di 7 giorni in ordine casuale. Questo design garantisce che qualsiasi variazione osservata nel metaboloma plasmatico sia attribuibile esclusivamente allo yogurt.

Durante tutti e quattro gli interventi, tutti i pasti e gli alimenti saranno forniti utilizzando un menu ciclico di 7 giorni, come fatto in precedenza dal nostro team [28-30]. La dieta di fondo per ciascun intervento sarà identica, priva di latticini (cioè escludendo tutti i latticini e il burro) e progettata per riflettere un'elevata aderenza alla guida alimentare canadese, con un'enfasi su alimenti vegetali minimamente processati. Per migliorare l'accettabilità e l'aderenza, il menu includerà almeno una ricetta dalla documentazione ufficiale della guida alimentare canadese ogni giorno [31, 32]. Un tecnico alimentare esperto preparerà le diete, con tutti gli alimenti e gli ingredienti pesati con precisione al decimo di grammo più vicino. Nel contesto dell'identificazione dei biomarcatori di assunzione, lo yogurt naturale è stato ritenuto la scelta più appropriata invece dello yogurt aromatizzato. Tuttavia, lo yogurt naturale è meno gradevole al palato a causa del suo sapore acido. Per affrontare questo, la dieta di fondo includerà una porzione giornaliera di piccoli frutti che i partecipanti saranno istruiti a mescolare nello yogurt (o nel budino di soia) o a consumare insieme. Poiché la porzione di frutta sarà standardizzata e consumata in quantità costanti ogni giorno attraverso i quattro interventi, non introdurrà confondimento nel processo di identificazione del biomarcatore dello yogurt. Consideriamo questo approccio anche favorevole per garantire la compliance durante la dieta contenente budino di soia.

Attraverso i quattro tipi di yogurt e i tre livelli di assunzione, lo yogurt contribuirà in media a 120 kcal/giorno, così come il budino di soia di controllo. Il contributo calorico più basso sarà di 40 kcal (yogurt normale magro naturale, 90 g/giorno), e il più alto sarà di 240 kcal (yogurt greco naturale con il 2% di grasso del latte; 350 g/giorno). Queste calorie saranno aggiunte a una dieta di fondo di 2.380 kcal/giorno per creare un menu standardizzato che in media raggiungerà 2.500 kcal/giorno attraverso i quattro interventi. Dato che gli interventi durano solo sette giorni, è improbabile che la differenza nel contributo calorico degli yogurt o del budino di soia influenzi il peso corporeo o introduca confondimento. L'approccio proposto - aggiungere gli alimenti testati a una dieta di fondo isoenergetica identica - è la strategia ottimale. Per un singolo partecipante, l'unica differenza tra le quattro diete sarà il contenuto di yogurt, garantendo che qualsiasi differenza post-dieta nel metaboloma plasmatico sia attribuibile esclusivamente allo yogurt. Al contrario, se optassimo per mantenere un contenuto calorico totale simile della dieta di fondo attraverso le quattro fasi, sarebbero necessarie modifiche alla dieta di fondo, il che introdurrebbe un bias nel metaboloma plasmatico. Al basale, i fabbisogni energetici dei partecipanti saranno stimati utilizzando equazioni predittive validate [33], e il contenuto energetico totale delle diete sarà adeguato di conseguenza per soddisfare questi requisiti.

Durante ciascuno dei quattro interventi di 7 giorni, i partecipanti dovranno consumare almeno tre pasti completi presso l'INAF sotto la supervisione del coordinatore della ricerca clinica (CRC). Durante queste visite, riceveranno anche i loro pasti per le successive 24-72 ore. Ai partecipanti sarà istruito di consumare solo gli alimenti forniti e di consumare tutti i pasti come forniti. Alcol, integratori vitaminici e prodotti naturali per la salute non saranno permessi. Tè e caffè (≤2 tazze/giorno) saranno consentiti, senza fluttuazioni giornaliere e senza latte, panna o zucchero. Sarà consentita una quantità illimitata di acqua. Ai partecipanti sarà istruito di mantenere il loro solito livello di attività fisica stabile per l'intero protocollo. Il 7° giorno di ciascuna dieta, i partecipanti si sottoporranno a un test acuto di pasto misto per informare sulla reattività temporale dei biomarcatori dello yogurt. Dopo un digiuno di 12 ore, i partecipanti arriveranno all'INAF alle 7:30 del mattino. Il pasto di test consisterà in un frullato per la colazione contenente lo stesso yogurt (o budino di soia) fornito giornalmente nei giorni precedenti. I campioni di plasma saranno raccolti al basale (digiuno) e a 1, 2, 4 e 6 ore dopo il pasto. I campioni saranno prelevati in provette EDTA e conservati a -80°C.

Durante il test, ai partecipanti sarà istruito di completare un richiamo dietetico auto-somministrato via web di 24 ore validato (il R24W), specificamente validato per la ricerca tra gli adulti del Quebec [34-40]. La metodologia completa e la validazione dietro il R24W sono pubblicate [34-40]. In breve, il R24W guida i partecipanti a indicare tutti gli alimenti e le bevande, compreso l'alcol, consumati durante il giorno precedente. Il R24W consente di selezionare alimenti e bevande consumati navigando attraverso un elenco strutturato di alimenti o utilizzando un motore di ricerca. Contiene anche immagini standardizzate per aiutare a valutare le dimensioni delle porzioni. Questi dati saranno utilizzati per confrontare le prestazioni del R24W con quelle dei biomarcatori dello yogurt nello stimare il vero contenuto di yogurt della dieta.

I partecipanti e il CRC non possono essere in cieco rispetto all'allocazione della dieta. Tuttavia, la quantità esatta di yogurt (o budino di soia) nelle diete non sarà rivelata ai partecipanti. Le quattro diete saranno etichettate casualmente con lettere (ad esempio, A=alto yogurt, B=soia, C=basso yogurt, D=moderato yogurt). Questo approccio minimizzerà il bias di informazione per il completamento del R24W alla fine di ogni intervento. Ogni intervento sarà separato da un periodo di washout di 1 settimana, per fornire ai partecipanti una pausa, riducendo il rischio di abbandoni associati a un intervento di più settimane. Durante il washout, ai partecipanti sarà istruito di tornare alla loro dieta abituale. Non anticipiamo alcun effetto di carryover della dieta durante il washout sui successivi periodi di intervento di 7 giorni per quanto riguarda l'identificazione del biomarcatore di assunzione di yogurt. Infatti, l'identificazione del biomarcatore di assunzione di yogurt sfrutterà i campioni di plasma raccolti il settimo giorno di ciascun intervento, sia in stato di digiuno che postprandiale. Quindi, è altamente improbabile che un biomarcatore da alimenti consumati durante il periodo di washout mostri la reattività postprandiale acuta attesa per il biomarcatore di assunzione di yogurt sotto il design proposto [27]. La partecipazione totale allo studio sarà di 7 settimane. Alla fine dello studio, per ciascun partecipante, avremo un totale di 15 campioni di plasma raccolti dopo il consumo di yogurt (cioè 5 campioni x 3 livelli di assunzione di yogurt) e 5 campioni raccolti dopo la dieta priva di yogurt, per un totale di 240 campioni post-yogurt e 80 senza yogurt (totale=320).

Compliance e abbandoni attesi: Verrà fornito un elenco di controllo per tracciare il consumo alimentare giornaliero. Avere 3 pasti completi consumati presso l'INAF sotto la supervisione del CRC rafforzerà l'aderenza al protocollo. Nei nostri studi precedenti con design simili, il 99% degli alimenti forniti è stato consumato [28, 29], con solo deviazioni aneddotiche, tutte auto-riferite. Il Prof. Drouin-Chartier ha originariamente sviluppato e utilizzato lo stesso menu di 7 giorni all'interno di uno studio RCT completamente alimentato finanziato dal CIHR in 50 adulti con ipercolesterolemia familiare eterozigote, con interventi della durata di 4 settimane. La compliance era >99% e la dieta era molto apprezzata, senza differenze tra partecipanti femmine e maschi. Abbiamo precedentemente condotto RCT completamente controllati di alimentazione di durata più lunga (ad esempio, 5×4 settimane o 3×6 settimane) con procedure più invasive (ad esempio, biopsie intestinali) e diete meno tipiche delle abitudini canadesi (ad esempio, mediterranea, priva di latticini), ma i tassi di abbandono non hanno mai superato il 20% [28, 29, 41]. I periodi di washout riducono il rischio di abbandono. Anticipiamo nessun problema di compliance. Abbiamo pianificato di arruolare 20 partecipanti, aspettandoci che almeno 16 completino l'intero protocollo.

Procedure di reclutamento: Criteri di inclusione: età: 18-70 anni; BMI: 18-40 kg/m²; disponibilità a consumare yogurt naturale giornalmente per 3 settimane; per consumatori di caffè/tè, disponibilità a consumare queste bevande senza aggiunta di latte, panna o zucchero per 4 settimane. Criteri di esclusione: intolleranza al lattosio; donazione di sangue entro 2 mesi; malattia cronica grave o trattamento in corso per condizioni come infezioni, malattie autoimmuni, cancro, diabete di tipo 2, malattia di Crohn, celiachia, malattie epatiche o renali; storia di cancro grave, malattia cardiovascolare o chirurgia bariatrica; peso corporeo instabile per 3 mesi; uso di droghe illecite o alcolismo; fumo/vaping di tabacco/cannabis (garantire che non ci siano fluttuazioni giorno per giorno e la segnalazione obiettiva del consumo è troppo complessa); allergie o avversioni ai componenti delle diete. I partecipanti saranno reclutati dall'area della città del Quebec attraverso e-mail di massa dall'INAF (raggiungimento: >5.000) e dall'Université Laval (>20.000). Gli individui interessati saranno invitati a contattare il CRC per una telefonata di screening. Gli individui idonei saranno poi invitati a una sessione informativa di persona, dove verranno spiegati tutti i dettagli del protocollo. Coloro che sono interessati saranno invitati a fornire il consenso informato. Successivamente, i partecipanti saranno randomizzati e sarà programmata una visita basale. Un totale di 10 diverse sequenze di randomizzazione saranno generate utilizzando il design di William per garantire che ogni trattamento segua ogni altro trattamento un numero uguale di volte. Ogni sequenza sarà attribuita a un singolo partecipante, in modo specifico per sesso. Anticipiamo che lo studio richiederà 20 settimane per essere completato. L'INAF ospita la più grande unità di ricerca sulla nutrizione clinica del Canada (800 m²), e una delle poche strutture nel paese in grado di condurre RCT completamente controllati. Dispone di una cucina metabolica, una mensa, spazi per la raccolta di campioni biologici, una piattaforma elettronica per la valutazione dietetica, la randomizzazione e la gestione dei partecipanti, e una piattaforma di metabolomica. Un infermiere di ricerca a tempo pieno è in servizio. Il centro dati dell'ULaval garantisce lo stoccaggio sicuro e la capacità analitica. Questa infrastruttura all'avanguardia è fondamentale per il successo del progetto.

Profilazione metabolomica: Una volta completato lo studio, i campioni di plasma saranno processati presso la piattaforma di metabolomica dell'INAF utilizzando quattro metodi LC complementari (ionizzazione elettrospray positiva e negativa) per determinare l'abbondanza relativa di ~22.000 metaboliti. Questi includono aminoacidi, zuccheri e acidi organici piccoli (BEH Amide); metaboliti di polifenoli e piccoli peptidi (HSS T3); acidi grassi liberi e acidi biliari (CSH C18); e lipidi (BEH C8). Oltre ai campioni di plasma, processeremo anche campioni di ciascuno dei 4 yogurt e del budino di soia. La profilazione metabolomica sarà condotta utilizzando un Thermo Vanquish U-HPLC accoppiato a uno spettrometro di massa Thermo Fusion Tribrid Orbitrap o un Waters Acquity I-Class UPLC accoppiato a un Waters Synapt G2-Si, a seconda del metodo. I dati grezzi saranno processati utilizzando Compound Discoverer e Progenesis QI. L'identificazione dei metaboliti sarà eseguita utilizzando la banca di standard analitici in continua crescita dell'INAF (n=1.000 composti, ad esempio, aminoacidi, metaboliti di origine intestinale, acidi biliari, composti fenolici, acidi grassi). Picchi cromatografici aggiuntivi di interesse subiranno identificazione putativa utilizzando multiple banche dati spettrali e molecolari (ad esempio, mzCloud, HMDB). La profilazione metabolomica dovrebbe richiedere 1 mese.

Analisi statistiche: Fase 1: identificazione di potenziali biomarcatori di assunzione di yogurt. Per fare questo, miriamo a identificare tutti i metaboliti che permettono di distinguere tra una dieta contenente yogurt e una priva di yogurt. Le variabili indipendenti includeranno l'abbondanza relativa di tutti i metaboliti (n=22.000) misurati dopo ciascuno dei quattro interventi, considerando i campioni di plasma per ciascun partecipante del presente studio (320 osservazioni, di cui 80 sono prive di yogurt), e dal nostro precedente studio sui biomarcatori di latte e formaggio (n=284 campioni di plasma privi di yogurt, processati utilizzando gli stessi metodi di metabolomica; totale=604). La variabile dipendente sarà "presenza di yogurt nella dieta" (sì/no). Utilizzeremo l'algoritmo di boosting a gradiente estremo (XGBoost) per addestrare modelli di classificazione [42]. Un processo iterativo sarà ripetuto n volte: (1) addestramento dei modelli, (2) identificazione del metabolita con la migliore capacità predittiva, calcolata mediante test di permutazione, e (3) rimozione di questo metabolita prima dell'iterazione successiva. Per ciascuna iterazione, 25 modelli saranno addestrati utilizzando diverse suddivisioni dei partecipanti in set di addestramento (80%; n=484 osservazioni) e di test (20%; n=120). Le iterazioni continueranno fino a quando l'intervallo di confidenza al 95% della sensibilità o specificità dei modelli raggiunge 0,5 (potere predittivo nullo di un algoritmo di classificazione). Alla fine di questa fase, gli n metaboliti rimossi costituiranno il pool di potenziali biomarcatori di assunzione di yogurt, che saranno trattenuti per le fasi successive. Le fasi successive sfrutteranno approcci statistici standard per testare le caratteristiche chiave di un biomarcatore validato di assunzione alimentare, come proposto da FoodBALL. Salvo diversa specificazione, tutti i seguenti test saranno condotti utilizzando modelli misti per misure ripetute, con l'abbondanza relativa dei metaboliti come variabile dipendente. I modelli saranno aggiustati per età, sesso, indice di massa corporea e calorie totali giornaliere dalla dieta.

Fase 2, reattività alla dose grezza: Confronteremo l'abbondanza relativa di ciascun potenziale biomarcatore seguendo diete prive di yogurt e contenenti yogurt. Solo i metaboliti la cui abbondanza aumenta con il consumo di yogurt procederanno alla fase successiva.

Fase 3, reattività alla dose raffinata: Confronteremo l'abbondanza relativa dei metaboliti attraverso i tre livelli di assunzione di yogurt testati nello studio. I metaboliti che mostrano una tendenza lineare significativa, con la dieta priva di yogurt codificata come 0, saranno trattenuti.

Fase 4, reattività temporale: Utilizzando i dati dei campioni di plasma raccolti durante il pasto di test acuto, valuteremo se l'abbondanza relativa dei metaboliti aumenta nel tempo. I metaboliti con un'area sotto la curva (AUC) maggiore dopo l'assunzione di yogurt rispetto al budino di soia saranno trattenuti.

Fase 5, specificità: Per confermare la specificità per lo yogurt, i metaboliti devono mostrare un'abbondanza aumentata con lo yogurt ma non con il latte o il formaggio. Per testare questo, utilizzeremo dati di metabolomica generati dal precedente grant DFC detenuto dal Prof. Drouin-Chartier. In questo precedente progetto, campioni di plasma raccolti da 4 RCT crossover precedentemente condotti con impostazioni di alimentazione completa mirate a valutare l'impatto dell'assunzione di latte o formaggio per 4-6 settimane sui fattori di rischio cardiometabolici sono stati utilizzati per identificare biomarcatori metabolici di assunzione di latte e formaggio, separatamente. Questo set di dati comprende dati di metabolomica da diete completamente controllate contenenti latte o formaggio e una dieta priva di latticini per 118 individui. I metaboliti la cui abbondanza non è aumentata da latte o formaggio saranno trattenuti alla fine di questa fase. Questo sarà condotto senza costi aggiuntivi.

Fase 6, robustezza: Utilizzeremo anche dati di metabolomica generati nel nostro precedente grant DFC. Questi proverranno da una coorte trasversale di 200 adulti che hanno fornito un campione di plasma a digiuno e completato tre richiami dietetici di 24 ore (R24W) nella settimana precedente il campionamento del plasma, incluso uno che riporta le loro assunzioni dietetiche il giorno prima del campionamento del plasma. I partecipanti saranno divisi per mediana di assunzione di yogurt. Solo i metaboliti con maggiore abbondanza nei partecipanti sopra la mediana saranno trattenuti. Questa fase non comporterà costi aggiuntivi.

Fase 7, plausibilità: Valuteremo la plausibilità dei metaboliti trattenuti come originati dallo yogurt in base alla loro natura e strutture chimiche, utilizzando il Milk Composition Database. In aggiunta, confronteremo questi metaboliti con i profili metabolomici dei quattro yogurt testati. Dopo questa fase, i metaboliti trattenuti avranno già soddisfatto i criteri essenziali di FoodBALL per essere considerati biomarcatori validati di assunzione di yogurt. Date le caratteristiche uniche della matrice dello yogurt, siamo fiduciosi nell'identificare almeno un metabolita che soddisfi tutti i criteri. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo identificato con successo un biomarcatore per l'assunzione di latte (delta-valerobetaina, un componente specifico del latte) e nove diversi altri per l'assunzione di formaggio.

Valutazione delle prestazioni: Addestreremo prima un modello per stimare l'assunzione di yogurt utilizzando i biomarcatori identificati incrociando la loro abbondanza relativa con i livelli noti di assunzione di yogurt forniti ai partecipanti durante lo studio. Questo sarà fatto utilizzando l'algoritmo Multimarker [43], che è stato specificamente sviluppato per modellare l'assunzione alimentare basata su biomarcatori [44]. Il modello genererà un'equazione di calibrazione che useremo per calibrare i dati del richiamo dietetico di 24 ore e produrre stime calibrate con biomarcatori dell'assunzione di yogurt. Successivamente, valuteremo l'accuratezza delle stime di assunzione di yogurt ottenute utilizzando: a) l'equazione di calibrazione (solo biomarcatori), b) il richiamo dietetico di 24 ore calibrato (biomarcatori × assunzione auto-riferita), e c) il richiamo dietetico di 24 ore non calibrato (solo assunzione auto-riferita), confrontando ciascuno con la vera assunzione fornita nei menu dello studio. Confronteremo i coefficienti di correlazione di Pearson e i loro intervalli di confidenza al 95% attraverso i metodi utilizzando test t.