Identificación de biomarcadores objetivos basados en metabolómica del consumo de yogur (YOGBIO)

La Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. consideró recientemente que la evidencia científica es lo suficientemente sólida como para aprobar una petición de declaración de propiedades saludables calificada sobre el yogur y la reducción del riesgo de diabetes tipo 2 (DT2). En contraste, Health Canada aún no ha aprobado una declaración similar. La evidencia existente se deriva exclusivamente de estudios de cohorte prospectivos que dependen de cuestionarios dietéticos autoinformados, que, a pesar de estar validados, están sujetos a errores aleatorios y sistemáticos que pueden comprometer la calidad de la evidencia y dificultar la aprobación regulatoria.

Los biomarcadores de la ingesta de alimentos son cada vez más reconocidos como herramientas valiosas para mejorar la objetividad en la epidemiología nutricional. La metabolómica, el perfilado integral de metabolitos plasmáticos, se considera el estándar de oro para identificar dichos biomarcadores. En el contexto de los lácteos, un hito importante fue la identificación de una firma metabolómica de la ingesta de yogur en una gran cohorte española. Esta firma, compuesta por 27 metabolitos (por ejemplo, esfingomielina C14:0, derivada del ácido mirístico), fue predictiva de la ingesta de yogur en una cohorte independiente de EE. UU. y se asoció con una menor incidencia de DT2 en ambas poblaciones. Sin embargo, debido a que esta firma se derivó de datos observacionales, carecía de especificidad para la ingesta de yogur.

Este proyecto busca llenar este vacío crítico mediante el descubrimiento de biomarcadores específicos de la ingesta de yogur y su validación según criterios reconocidos.

Realizaremos un ensayo de alimentación aleatorizado, cruzado, de respuesta a la dosis que involucrará a 16 adultos generalmente sanos (8 mujeres, 8 hombres). El ensayo consistirá en 4 dietas predeterminadas, cada una con una duración de 7 días y separadas por un período de lavado de 1 semana. En el día 7 de cada dieta, los participantes se someterán a una prueba de comida mixta en INAF para recolectar muestras de plasma en estado posprandial. Las 4 dietas se basarán en una dieta de fondo sin lácteos que refleje una alta adherencia a la guía alimentaria de Canadá, con las siguientes adiciones:

1. 125 g por 2.380 kcal por día de un pudín a base de soja (es decir, dieta sin yogur);
2. 90 g por 2.380 kcal por día de yogur (es decir, 0.5 porción de referencia de yogur por 2.380 kcal por día);
3. 175 g por 2.380 kcal por día de yogur (es decir, 1 porción de referencia de yogur por 2.380 kcal por día);
4. 350 g por 2.380 kcal por día de yogur (es decir, 2 porciones de referencia por 2.380 kcal por día).

Para garantizar que los biomarcadores identificados reflejen la diversidad de yogures, se probarán cuatro variedades de yogur:

a) yogur natural regular sin grasa; b) yogur natural regular con 2% de grasa láctea; c) yogur griego natural sin grasa; d) yogur griego natural con 2% de grasa láctea. Cada tipo de yogur se asignará a cuatro participantes, quienes consumirán el mismo tipo consistentemente durante todo el estudio. El objetivo no es identificar un biomarcador distinto para cada tipo de yogur, sino garantizar que el(los) biomarcador(es) identificado(s) tengan en cuenta la diversidad de tipos de yogur. Para la intervención sin yogur, todos los participantes consumirán el mismo pudín a base de soja. Los participantes completarán las cuatro intervenciones de 7 días en orden aleatorio. Este diseño garantiza que cualquier variación observada en el metaboloma plasmático se atribuya únicamente al yogur.

Durante las cuatro intervenciones, todas las comidas y alimentos se proporcionarán utilizando un menú cíclico de 7 días, como se hizo anteriormente por nuestro equipo [28-30]. La dieta de fondo para cada intervención será idéntica, sin lácteos (es decir, excluyendo todos los lácteos y mantequilla), y diseñada para reflejar una alta adherencia a la guía alimentaria de Canadá, con énfasis en alimentos vegetales mínimamente procesados. Para mejorar la aceptabilidad y adherencia, el menú incluirá al menos una receta de la documentación oficial de la guía alimentaria de Canadá cada día [31, 32]. Un técnico de alimentos experimentado preparará las dietas, con todos los alimentos e ingredientes pesados con precisión hasta el 0,1 g más cercano. En el contexto de la identificación de biomarcadores de ingesta, el yogur natural se consideró la opción más apropiada en lugar del yogur saborizado. Sin embargo, el yogur natural es menos apetecible debido a su sabor agrio. Para abordar esto, la dieta de fondo incluirá una porción diaria de frutas pequeñas que los participantes recibirán instrucciones de mezclar en el yogur (o pudín de soja) o consumir junto con él. Dado que la porción de fruta será estandarizada y se consumirá en cantidades consistentes cada día en las cuatro intervenciones, no introducirá confusión en el proceso de identificación de biomarcadores del yogur. Consideramos que este enfoque también es favorable para garantizar el cumplimiento durante la dieta que contiene pudín de soja.

A través de los cuatro tipos de yogur y tres niveles de ingesta, el yogur contribuirá en promedio con 120 kcal/día, al igual que el pudín de soja control. La contribución calórica más baja será de 40 kcal (yogur natural regular sin grasa, 90 g/día), y la más alta será de 240 kcal (yogur griego natural con 2% de grasa láctea; 350 g/día). Estas calorías se agregarán a una dieta de fondo de 2.380 kcal/día para crear un menú estandarizado que promediará 2.500 kcal/día en las cuatro intervenciones. Dado que las intervenciones duran solo siete días, es poco probable que la diferencia en la contribución calórica de los yogures o el pudín de soja afecte el peso corporal o introduzca confusión. El enfoque propuesto, agregar los alimentos probados a una dieta de fondo isoenergética idéntica, es la estrategia óptima. Para un solo participante, la única diferencia entre las cuatro dietas será el contenido de yogur, garantizando que cualquier diferencia posdieta en el metaboloma plasmático sea atribuible únicamente al yogur. Por el contrario, si optáramos por mantener un contenido calórico total similar de la dieta de fondo en las cuatro fases, se requerirían cambios en la dieta de fondo, lo que introduciría sesgo en el metaboloma plasmático. Al inicio, los requerimientos energéticos de los participantes se estimarán utilizando ecuaciones predictivas validadas [33], y el contenido energético total de las dietas se ajustará en consecuencia para cumplir con estos requerimientos.

Durante cada una de las cuatro intervenciones de 7 días, se requerirá que los participantes consuman al menos tres comidas completas en INAF bajo la supervisión del coordinador de investigación clínica (CRC). Durante estas visitas, también recibirán sus comidas para las próximas 24 a 72 horas. Se instruirá a los participantes a consumir solo los alimentos proporcionados y a consumir todas las comidas según se suministren. No se permitirá alcohol, suplementos vitamínicos ni productos de salud naturales. Se permitirán té y café (≤2 tazas/día), sin fluctuaciones diarias y sin leche, crema o azúcar. Se permitirá cantidad ilimitada de agua. Se instruirá a los participantes a mantener su nivel de actividad física habitual estable durante todo el protocolo. En el día 7 de cada dieta, los participantes se someterán a una prueba aguda de comida mixta para informar sobre la capacidad de respuesta temporal de los biomarcadores del yogur. Después de un ayuno de 12 horas, los participantes llegarán a INAF a las 7:30 a.m. La comida de prueba consistirá en un batido de desayuno que contenga el mismo yogur (o pudín de soja) proporcionado diariamente durante los días anteriores. Se recolectarán muestras de plasma en línea de base (en ayunas) y a 1, 2, 4 y 6 horas después de la comida. Las muestras se extraerán en tubos EDTA y se almacenarán a -80 °C.

Durante la prueba, se instruirá a los participantes a completar un recordatorio dietético web autoadministrado validado de 24 horas (el R24W), específicamente validado para investigación entre adultos de Quebec [34-40]. La metodología completa y la validación detrás del R24W están publicadas [34-40]. Brevemente, el R24W guía a los participantes a indicar todos los alimentos y bebidas, incluido el alcohol, consumidos durante el día anterior. El R24W permite seleccionar alimentos y bebidas consumidos navegando a través de una lista estructurada de alimentos o utilizando un motor de búsqueda. También contiene imágenes estandarizadas para ayudar a evaluar el tamaño de las porciones. Estos datos se utilizarán para comparar el rendimiento del R24W con el de los biomarcadores del yogur en la estimación del verdadero contenido de yogur de la dieta.

Los participantes y el CRC no pueden estar cegados a la asignación de la dieta. Sin embargo, la cantidad exacta de yogur (o pudín de soja) en las dietas no se revelará a los participantes. Las cuatro dietas se etiquetarán aleatoriamente con letras (por ejemplo, A=alto en yogur, B=soja, C=bajo en yogur, D=moderado en yogur). Este enfoque minimizará el sesgo de información para la finalización del R24W al final de cada intervención. Cada intervención estará separada por un período de lavado de 1 semana, para brindar a los participantes un descanso, reduciendo el riesgo de abandonos asociados con una intervención de varias semanas. Durante el lavado, se instruirá a los participantes a volver a su dieta habitual. No anticipamos ningún efecto de arrastre de la dieta durante el lavado en los períodos de intervención posteriores de 7 días con respecto a la identificación de biomarcadores de ingesta de yogur. De hecho, la identificación del biomarcador de ingesta de yogur aprovechará las muestras de plasma recolectadas el día siete de cada intervención, tanto en estado de ayuno como posprandial. Por lo tanto, es muy poco probable que un biomarcador de alimentos consumidos durante el período de lavado exhiba la capacidad de respuesta posprandial aguda esperada para el biomarcador de ingesta de yogur bajo el diseño propuesto [27]. La participación total en el ensayo será de 7 semanas. Al final del ensayo, para cada participante, tendremos un total de 15 muestras de plasma recolectadas después del consumo de yogur (es decir, 5 muestras × 3 niveles de ingesta de yogur) y 5 muestras recolectadas después de la dieta sin yogur, para un total de 240 muestras posyogur y 80 sin yogur (total=320).

Cumplimiento y abandonos esperados: Se proporcionará una lista de verificación para rastrear el consumo diario de alimentos. Tener 3 comidas completas consumidas en INAF bajo la supervisión del CRC reforzará la adherencia al protocolo. En nuestros estudios anteriores con diseños similares, se consumió el 99% de los alimentos proporcionados [28, 29], con solo desviaciones anecdóticas, todas autoinformadas. El Prof. Drouin-Chartier originalmente desarrolló y utilizó el mismo menú de 7 días dentro de un ECA completamente alimentado financiado por CIHR en 50 adultos con hipercolesterolemia familiar heterocigota, con intervenciones que duraron 4 semanas. El cumplimiento fue >99% y la dieta fue muy apreciada, sin diferencias entre participantes femeninas y masculinos. Hemos realizado previamente ECAs de alimentación completamente controlada de mayor duración (por ejemplo, 5×4 semanas o 3×6 semanas) con procedimientos más invasivos (por ejemplo, biopsias intestinales) y dietas menos típicas de los hábitos canadienses (por ejemplo, mediterránea, sin lácteos), sin embargo, las tasas de abandono nunca excedieron el 20% [28, 29, 41]. Los períodos de lavado reducen el riesgo de abandono. Anticipamos ningún problema de cumplimiento. Planeamos reclutar 20 participantes, esperando que al menos 16 completen el protocolo completo.

Procedimientos de reclutamiento: Criterios de inclusión: edad: 18-70 años; IMC: 18-40 kg/m²; disposición a consumir yogur natural diariamente durante 3 semanas; para consumidores de café/té, disposición a consumir estas bebidas sin leche, crema o azúcar añadidos durante 4 semanas. Criterios de exclusión: intolerancia a la lactosa; donación de sangre dentro de 2 meses; enfermedad crónica grave o tratamiento en curso para afecciones como infecciones, enfermedades autoinmunes, cáncer, diabetes tipo 2, enfermedad de Crohn, enfermedad celíaca, enfermedades hepáticas o renales; antecedentes de cáncer grave, enfermedad cardiovascular o cirugía bariátrica; peso corporal inestable durante 3 meses; uso de drogas ilícitas o alcoholismo; tabaquismo/vapeo de tabaco/cannabis (garantizar que no haya fluctuaciones día a día y la notificación objetiva del consumo es demasiado compleja); alergias o aversiones a componentes de las dietas. Los participantes serán reclutados del área de la ciudad de Quebec a través de correos masivos de INAF (alcance: >5.000) y la Université Laval (>20.000). Las personas interesadas serán invitadas a contactar al CRC para una llamada telefónica de selección. Los individuos elegibles serán invitados a una sesión de información en persona, donde se explicarán todos los detalles del protocolo. Los interesados serán solicitados a proporcionar consentimiento informado. Después, los participantes serán aleatorizados y se programará una visita basal. Se generarán un total de 10 secuencias de aleatorización diferentes utilizando el diseño de William para garantizar que cada tratamiento siga a cada otro tratamiento un número igual de veces. Cada secuencia se atribuirá a un solo participante, de manera específica por sexo. Anticipamos que el ensayo requerirá 20 semanas para completarse. INAF alberga la unidad de investigación de nutrición clínica más grande de Canadá (800 m²), y una de las pocas instalaciones en el país capaz de realizar ECAs completamente controlados. Cuenta con una cocina metabólica, cafetería, espacios para recolección de especímenes biológicos, una plataforma electrónica para evaluación dietética, aleatorización y gestión de participantes, y una plataforma de metabolómica. Una enfermera de investigación a tiempo completo está en plantilla. El centro de datos de ULaval garantiza almacenamiento seguro y capacidad analítica. Esta infraestructura de vanguardia es clave para el éxito del proyecto.

Perfilado metabolómico: Una vez completado el ensayo, las muestras de plasma se procesarán en la plataforma de metabolómica de INAF utilizando cuatro métodos de LC complementarios (ionización por electrospray positiva y negativa) para determinar la abundancia relativa de ~22.000 metabolitos. Estos incluyen aminoácidos, azúcares y ácidos orgánicos pequeños (BEH Amida); metabolitos de polifenoles y péptidos pequeños (HSS T3); ácidos grasos libres y ácidos biliares (CSH C18); y lípidos (BEH C8). Además de las muestras de plasma, también procesaremos muestras de cada uno de los 4 yogures y el pudín de soja. El perfilado metabolómico se llevará a cabo utilizando un Thermo Vanquish U-HPLC acoplado a un espectrómetro de masas Thermo Fusion Tribrid Orbitrap o un Waters Acquity I-Class UPLC acoplado a un Waters Synapt G2-Si, dependiendo del método. Los datos brutos se procesarán utilizando Compound Discoverer y Progenesis QI. La identificación de metabolitos se realizará utilizando el banco de estándares analíticos en constante crecimiento de INAF (n=1.000 compuestos, por ejemplo, aminoácidos, metabolitos derivados del intestino, ácidos biliares, compuestos fenólicos, ácidos grasos). Los picos cromatográficos adicionales de interés se someterán a identificación putativa utilizando múltiples bases de datos espectrales y moleculares (por ejemplo, mzCloud, HMDB). Se espera que el perfilado metabolómico tome 1 mes.

Análisis estadísticos: Paso 1: identificación de biomarcadores potenciales de la ingesta de yogur. Para hacer esto, nuestro objetivo es identificar todos los metabolitos que permitan distinguir entre una dieta que contiene yogur y una dieta sin yogur. Las variables independientes incluirán la abundancia relativa de todos los metabolitos (n=22.000) medidos después de cada una de las cuatro intervenciones, considerando muestras de plasma para cada participante del presente ensayo (320 observaciones, de las cuales 80 son sin yogur), y de nuestro estudio anterior de biomarcadores de leche y queso (n=284 muestras de plasma sin yogur, procesadas utilizando los mismos métodos de metabolómica; total=604). La variable dependiente será "presencia de yogur en la dieta" (sí/no). Utilizaremos el algoritmo de aumento de gradiente extremo (XGBoost) para entrenar modelos de clasificación [42]. Se repetirá un proceso iterativo n veces: (1) entrenar los modelos, (2) identificar el metabolito con la mejor capacidad predictiva, calculada mediante pruebas de permutación, y (3) eliminar este metabolito antes de la siguiente iteración. Para cada iteración, se entrenarán 25 modelos utilizando diferentes divisiones de participantes en conjuntos de entrenamiento (80%; n=484 observaciones) y prueba (20%; n=120). Las iteraciones continuarán hasta que el intervalo de confianza del 95% de sensibilidad o especificidad de los modelos alcance 0.5 (poder predictivo nulo de un algoritmo de clasificación). Al final de este paso, los n metabolitos eliminados constituirán el grupo de biomarcadores potenciales de la ingesta de yogur, que se retendrán para los pasos posteriores. Los pasos posteriores aprovecharán enfoques estadísticos estándar para probar las características clave de un biomarcador validado de ingesta de alimentos, según lo propuesto por FoodBALL. A menos que se especifique lo contrario, todas las pruebas siguientes se realizarán utilizando modelos mixtos para medidas repetidas, con la abundancia relativa de metabolitos como variable dependiente. Los modelos se ajustarán por edad, sexo, índice de masa corporal y calorías totales diarias de la dieta.

Paso 2, capacidad de respuesta a la dosis cruda: Compararemos la abundancia relativa de cada biomarcador potencial después de dietas sin yogur y con yogur. Solo los metabolitos cuya abundancia aumente con el consumo de yogur procederán al siguiente paso.

Paso 3, capacidad de respuesta a la dosis refinada: Compararemos la abundancia relativa de metabolitos en los tres niveles de ingesta de yogur probados en el estudio. Se retendrán los metabolitos que muestren una tendencia lineal significativa, con la dieta sin yogur codificada como 0.

Paso 4, capacidad de respuesta temporal: Utilizando datos de muestras de plasma recolectadas durante la comida de prueba aguda, evaluaremos si la abundancia relativa de metabolitos aumenta con el tiempo. Se retendrán los metabolitos con un área bajo la curva (AUC) mayor después de la ingesta de yogur en comparación con el pudín de soja.

Paso 5, especificidad: Para confirmar la especificidad al yogur, los metabolitos deben mostrar mayor abundancia con el yogur pero no con la leche o el queso. Para probar esto, utilizaremos datos de metabolómica generados de la subvención DFC anterior del Prof. Drouin-Chartier. En este proyecto anterior, se utilizaron muestras de plasma recolectadas de 4 ECAs cruzados previamente realizados con entornos de alimentación completa que tenían como objetivo evaluar el impacto de la ingesta de leche o queso durante 4 a 6 semanas en factores de riesgo cardiometabólico para identificar biomarcadores metabólicos de ingesta de leche y queso, por separado. Este conjunto de datos comprende datos de metabolómica de dietas completamente controladas con leche o queso y una dieta sin lácteos para 118 individuos. Los metabolitos cuya abundancia no aumente por la leche o el queso se retendrán al final de este paso. Esto se realizará sin costo adicional.

Paso 6, robustez: También utilizaremos datos de metabolómica generados en nuestra subvención DFC pasada. Estos provendrán de una cohorte transversal de 200 adultos que proporcionaron una muestra de plasma en ayunas y completaron tres recordatorios dietéticos de 24 horas (R24W) en la semana anterior al muestreo de plasma, incluido uno que informa sobre sus ingestas dietéticas el día anterior al muestreo de plasma. Los participantes se dividirán por ingesta mediana de yogur. Solo los metabolitos con mayor abundancia en participantes por encima de la mediana se retendrán. Este paso tampoco incurrirá en costo adicional.

Paso 7, plausibilidad: Evaluaremos la plausibilidad de que los metabolitos retenidos se originen del yogur basándonos en su naturaleza y estructuras químicas, utilizando la Base de Datos de Composición de la Leche. Además, compararemos estos metabolitos con los perfiles metabolómicos de los cuatro yogures probados. Después de este paso, los metabolitos retenidos ya habrán satisfecho los criterios esenciales de FoodBALL para ser considerados biomarcadores validados de la ingesta de yogur. Dadas las características únicas de la matriz del yogur, confiamos en identificar al menos un metabolito que cumpla con todos los criterios. En nuestro trabajo anterior, identificamos con éxito un biomarcador para la ingesta de leche (delta-valerobetaína, un componente específico de la leche) y nueve diferentes para la ingesta de queso.

Evaluación del rendimiento: Primero entrenaremos un modelo para estimar la ingesta de yogur utilizando los biomarcadores identificados cruzando referencias de su abundancia relativa con los niveles conocidos de ingesta de yogur proporcionados a los participantes durante el ensayo. Esto se hará utilizando el algoritmo Multimarker [43], que fue desarrollado específicamente para modelar la ingesta de alimentos basada en biomarcadores [44]. El modelo generará una ecuación de calibración que usaremos para calibrar los datos de recordatorio dietético de 24 horas y producir estimaciones de ingesta de yogur calibradas por biomarcadores. A continuación, evaluaremos la precisión de las estimaciones de ingesta de yogur obtenidas utilizando: a) la ecuación de calibración (solo biomarcadores), b) el recordatorio dietético de 24 horas calibrado (biomarcadores × ingesta autoinformada), y c) el recordatorio dietético de 24 horas no calibrado (solo ingesta autoinformada), comparando cada una con la ingesta verdadera proporcionada en los menús del estudio. Compararemos los coeficientes de correlación de Pearson y sus intervalos de confianza del 95% entre métodos utilizando pruebas t.