요거트 섭취의 객관적 대사체학 기반 바이오마커 식별 (YOGBIO)

미국 식품의약국(FDA)은 최근 요구르트와 2형 당뇨병(T2D) 위험 감소에 관한 적격 건강 표시 청원을 승인하기에 충분히 강력한 과학적 증거가 있다고 판단했습니다. 이와 대조적으로, 캐나다 보건부는 아직 유사한 표시를 승인하지 않았습니다. 기존 증거는 전향적 코호트 연구에서만 도출되었으며, 이 연구들은 자가 보고식 식이 설문지를 사용합니다. 이러한 설문지들은 검증되었음에도 불구하고 무작위 오류와 체계적 오류의 영향을 받아 증거의 질을 저하시키고 규제 승인을 방해할 수 있습니다.

식품 섭취 바이오마커는 영양 역학에서 객관성을 향상시키는 가치 있는 도구로 점차 인식되고 있습니다. 대사체학은 혈장 대사체의 포괄적인 프로파일링으로, 이러한 바이오마커를 식별하는 데 있어 골드 스탠더드로 간주됩니다. 유제품 분야에서 주요 이정표는 대규모 스페인 코호트에서 요구르트 섭취의 대사체학적 시그니처를 식별한 것입니다. 이 시그니처는 27개의 대사체(예: 미리스트산에서 유래한 C14:0 스핑고미엘린)로 구성되며, 독립적인 미국 코호트에서 요구르트 섭취를 예측했고 두 인구 집단에서 더 낮은 T2D 발병률과 연관되었습니다. 그러나 이 시그니처가 관찰 데이터에서 도출되었기 때문에 요구르트 섭취에 대한 특이성이 부족했습니다.

이 프로젝트는 요구르트 섭취의 특정 바이오마커를 발견하고 인정된 기준에 대해 검증함으로써 이 중요한 격차를 메우고자 합니다.

우리는 일반적으로 건강한 성인 16명(여성 8명, 남성 8명)을 대상으로 한 무작위 교차 용량-반응 급여 시험을 수행할 것입니다. 이 시험은 각각 7일 동안 지속되고 1주일의 워시아웃 기간으로 구분된 4가지 사전 결정된 식단으로 구성됩니다. 각 식단의 7일째에 참가자들은 INAF에서 혼합 식사 테스트를 받아 식후 상태의 혈장 샘플을 수집할 것입니다. 4가지 식단은 캐나다 식사 가이드에 대한 높은 준수를 반영하는 무유제품 배경 식단을 기반으로 하며, 다음과 같은 추가 사항이 있습니다:

1. 1일 2,380 kcal당 125g의 대두 기반 푸딩(즉, 무요구르트 식단);
2. 1일 2,380 kcal당 90g의 요구르트(즉, 1일 2,380 kcal당 0.5 기준 서빙의 요구르트);
3. 1일 2,380 kcal당 175g의 요구르트(즉, 1일 2,380 kcal당 1 기준 서빙의 요구르트);
4. 1일 2,380 kcal당 350g의 요구르트(즉, 1일 2,380 kcal당 2 기준 서빙).

식별된 바이오마커가 다양한 요구르트를 반영하도록 보장하기 위해 네 가지 요구르트 종류가 테스트될 것입니다:

a) 무지방 일반 플레인 요구르트; b) 2% 유지방 일반 플레인 요구르트; c) 무지방 그리스식 플레인 요구르트; d) 2% 유지방 그리스식 플레인 요구르트. 각 요구르트 유형은 네 명의 참가자에게 할당되며, 이들은 연구 기간 동안 동일한 유형을 꾸준히 섭취할 것입니다. 목표는 각 요구르트 유형에 대해 별개의 바이오마커를 식별하는 것이 아니라, 식별된 바이오마커(들)가 요구르트 유형의 다양성을 설명하도록 보장하는 것입니다. 무요구르트 중재의 경우, 모든 참가자가 동일한 대두 기반 푸딩을 섭취할 것입니다. 참가자들은 무작위 순서로 네 번의 7일 중재를 완료할 것입니다. 이 설계는 혈장 대사체에서 관찰된 모든 변이가 오로지 요구르트에 기인하도록 보장합니다.

네 번의 중재 모두 동안, 모든 식사와 음식은 우리 팀이 이전에 수행한 바와 같이 7일 순환 메뉴를 사용하여 제공될 것입니다 [28-30]. 각 중재의 배경 식단은 동일하고, 무유제품(즉, 모든 유제품과 버터 제외)이며, 캐나다 식사 가이드에 대한 높은 준수를 반영하도록 설계될 것이며, 최소 가공 식물 기반 식품에 중점을 둘 것입니다. 수용성과 준수를 향상시키기 위해, 메뉴에는 매일 공식 캐나다 식사 가이드 문서에서 최소 하나의 레시피가 포함될 것입니다 [31, 32]. 숙련된 식품 기술자가 식단을 준비하며, 모든 음식과 재료는 0.1g 단위로 정확하게 계량될 것입니다. 섭취 바이오마커 식별의 맥락에서, 플레인 요구르트가 향이 첨가된 요구르트 대신 가장 적절한 선택으로 간주되었습니다. 그러나 플레인 요구르트는 신맛 때문에 덜 맛이 좋습니다. 이를 해결하기 위해, 배경 식단에는 참가자들이 요구르트(또는 대두 푸딩)에 섞어 먹거나 함께 섭취하도록 지시받을 작은 과일의 일일 서빙이 포함될 것입니다. 과일 서빙은 표준화되고 네 번의 중재 동안 매일 일관된 양으로 섭취되므로, 요구르트 바이오마커 식별 과정에 혼란을 초래하지 않을 것입니다. 우리는 이 접근법이 대두 기반 푸딩이 포함된 식단 동안의 준수를 보장하는 데에도 유리하다고 생각합니다.

네 가지 요구르트 유형과 세 가지 섭취 수준에 걸쳐, 요구르트는 평균 120 kcal/일을 기여할 것이며, 대조군 대두 기반 푸딩도 마찬가지입니다. 가장 낮은 열량 기여는 40 kcal(무지방 일반 플레인 요구르트, 90 g/일)이고, 가장 높은 열량 기여는 240 kcal(2% 유지방 그리스식 플레인 요구르트; 350 g/일)입니다. 이러한 열량은 2,380 kcal/일 배경 식단에 추가되어 네 번의 중재에 걸쳐 평균 2,500 kcal/일이 되는 표준화된 메뉴를 만들 것입니다. 중재가 단 7일 동안 지속되기 때문에, 요구르트나 대두 기반 푸딩의 열량 기여 차이가 체중에 영향을 미치거나 혼란을 초래할 가능성은 낮습니다. 제안된 접근법—테스트된 음식을 동일한 등열량 배경 식단에 추가하는 것—이 최적의 전략입니다. 단일 참가자에게 있어, 네 가지 식단 간의 유일한 차이는 요구르트 함량이며, 이는 식단 후 혈장 대사체의 모든 차이가 오로지 요구르트에 기인하도록 보장합니다. 반대로, 네 단계에 걸쳐 유사한 총 열량 함량의 배경 식단을 유지하려고 한다면, 배경 식단에 변경이 필요할 것이며, 이는 혈장 대사체에 편향을 초래할 것입니다. 기준선에서 참가자의 에너지 요구량은 검증된 예측 방정식을 사용하여 추정될 것이며 [33], 식단의 총 에너지 함량은 이 요구량을 충족하도록 조정될 것입니다.

네 번의 7일 중재 각각 동안, 참가자들은 임상 연구 코디네이터(CRC)의 감독 하에 INAF에서 최소 세 번의 완전한 식사를 섭취해야 합니다. 이러한 방문 동안, 그들은 또한 다음 24~72시간 동안의 식사를 받을 것입니다. 참가자들은 제공된 음식만 섭취하고 공급된 대로 모든 식사를 섭취하도록 지시받을 것입니다. 알코올, 비타민 보충제, 천연 건강 제품은 허용되지 않습니다. 차와 커피(≤2잔/일)는 허용되며, 일일 변동 없이 우유, 크림 또는 설탕 없이 섭취해야 합니다. 무제한의 물 섭취가 허용됩니다. 참가자들은 전체 프로토콜 동안 평소의 신체 활동 수준을 안정적으로 유지하도록 지시받을 것입니다. 각 식단의 7일째에, 참가자들은 요구르트 바이오마커의 시간 반응성을 알리기 위한 급성 혼합 식사 테스트를 받을 것입니다. 12시간 금식 후, 참가자들은 오전 7시 30분에 INAF에 도착할 것입니다. 테스트 식사는 이전 날 동안 매일 제공된 동일한 요구르트(또는 대두 기반 푸딩)를 포함하는 아침 스무디로 구성될 것입니다. 혈장 샘플은 기준선(공복 시)과 식후 1, 2, 4, 6시간에 수집될 것입니다. 샘플은 EDTA 튜브에 채취되어 -80°C에 보관될 것입니다.

테스트 동안, 참가자들은 검증된 자가 관리 웹 기반 24시간 식이 회상(R24W)을 완료하도록 지시받을 것이며, 이는 퀘벡 성인을 대상으로 한 연구에 대해 특별히 검증되었습니다 [34-40]. R24W의 전체 방법론과 검증은 출판되었습니다 [34-40]. 간단히 말해, R24W는 참가자들에게 전날 섭취한 모든 음식과 음료(알코올 포함)를 표시하도록 안내합니다. R24W는 구조화된 음식 목록을 탐색하거나 검색 엔진을 사용하여 섭취한 음식과 음료를 선택할 수 있게 합니다. 또한 포션 크기를 평가하는 데 도움이 되는 표준화된 이미지를 포함합니다. 이러한 데이터는 R24W의 성능을 요구르트 바이오마커의 성능과 비교하여 식단의 실제 요구르트 함량을 추정하는 데 사용될 것입니다.

참가자와 CRC는 식단 할당에 대해 눈가림될 수 없습니다. 그러나 식단의 정확한 요구르트(또는 대두 기반 푸딩) 양은 참가자들에게 공개되지 않을 것입니다. 네 가지 식단은 무작위로 문자로 표시될 것입니다(예: A=고요구르트, B=대두, C=저요구르트, D=중요구르트). 이 접근법은 각 중재 종료 시 R24W 완료에 대한 정보 편향을 최소화할 것입니다. 각 중재는 1주일의 워시아웃 기간으로 구분되어 참가자들에게 휴식을 제공하며, 다주간 중재와 관련된 탈락 위험을 줄일 것입니다. 워시아웃 동안, 참가자들은 평소 식단으로 돌아가도록 지시받을 것입니다. 우리는 워시아웃 동안의 식단이 이후의 7일 중재 기간에 요구르트 섭취 바이오마커 식별에 대해 어떠한 이월 효과도 가질 것이라고 예상하지 않습니다. 실제로, 요구르트 섭취 바이오마커의 식별은 각 중재의 7일째에 수집된 혈장 샘플, 즉 공복 시와 식후 상태 모두를 활용할 것입니다. 따라서, 제안된 설계 하에서 요구르트 섭취 바이오마커에 대해 예상되는 급성 식후 반응성을 나타내는 워시아웃 기간 동안 섭취된 음식의 바이오마커가 나타날 가능성은 매우 낮습니다 [27]. 전체 시험 참여는 7주간입니다. 시험 종료 시, 각 참가자에 대해 우리는 요구르트 섭취 후 총 15개의 혈장 샘플(즉, 5샘플 × 3요구르트 섭취 수준)과 무요구르트 식단 후 5개의 샘플을 수집하게 되어, 총 240개의 요구르트 후 샘플과 80개의 무요구르트 샘플(총=320)을 갖게 될 것입니다.

준수 및 예상 탈락: 일일 음식 섭취를 추적하기 위한 체크리스트가 제공될 것입니다. CRC의 감독 하에 INAF에서 3회의 완전한 식사를 섭취하는 것이 프로토콜 준수를 강화할 것입니다. 우리의 이전 유사 설계 연구에서, 제공된 음식의 99%가 섭취되었으며 [28, 29], 일화적인 편차만 있었고 모두 자가 보고되었습니다. Drouin-Chartier 교수는 원래 이 7일 메뉴를 개발하여 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증이 있는 50명의 성인을 대상으로 CIHR 자금 지원 완전 급여 무작위 대조 시험에서 사용했으며, 중재는 4주간 지속되었습니다. 준수율은 >99%였고 식단은 매우 호평받았으며, 여성과 남성 참가자 간 차이는 없었습니다. 우리는 이전에 더 긴 기간(예: 5×4주 또는 3×6주)의 완전 통제 급여 무작위 대조 시험을 더 침습적인 절차(예: 장 생검)와 캐나다 습관에 덜 전형적인 식단(예: 지중해식, 무유제품)으로 수행했으나, 탈락률은 결코 20%를 초과하지 않았습니다 [28, 29, 41]. 워시아웃 기간은 탈락 위험을 낮춥니다. 우리는 준수 문제가 없을 것으로 예상합니다. 우리는 20명의 참가자를 등록할 계획이며, 최소 16명이 전체 프로토콜을 완료할 것으로 기대합니다.

모집 절차: 포함 기준: 연령: 18-70세; 체질량지수: 18-40 kg/m²; 3주 동안 매일 플레인 요구르트를 섭취할 의지; 커피/차 소비자의 경우, 4주 동안 우유, 크림 또는 설탕 없이 이러한 음료를 섭취할 의지. 제외 기준: 젖당 불내증; 2개월 이내 헌혈; 심각한 만성 질환이나 감염, 자가면역 질환, 암, 2형 당뇨병, 크론병, 섬유증, 간 또는 신장 질환과 같은 상태에 대한 지속적인 치료; 심각한 암, 심혈관 질환 또는 비만 수술 병력; 3개월 동안 불안정한 체중; 불법 약물 사용 또는 알코올 중독; 담배/대마초 흡연/베이핑(일일 변동 없이 소비를 객관적으로 보고하는 것이 너무 복잡함); 식단 구성 요소에 대한 알레르기 또는 혐오감. 참가자는 INAF(접근성: >5,000)와 라발 대학(>20,000)의 대량 이메일을 통해 퀘벡 시 지역에서 모집될 것입니다. 관심 있는 개인은 CRC에게 연락하여 선별 전화 통화를 하도록 초대될 것입니다. 적격한 개인은 대면 정보 세션에 초대될 것이며, 여기서 프로토콜의 전체 세부 사항이 설명될 것입니다. 관심 있는 사람들은 동의서를 제공하도록 요청받을 것입니다. 이후 참가자들은 무작위 배정되고 기준선 방문이 예정될 것입니다. 총 10개의 다른 무작위 순서가 William의 설계를 사용하여 생성되어 각 처리가 다른 모든 처리를 동일한 횟수만큼 따르도록 보장할 것입니다. 각 순서는 성별별로 단일 참가자에게 할당될 것입니다. 우리는 시험이 완료되는 데 20주가 걸릴 것으로 예상합니다. INAF는 캐나다에서 가장 큰 임상 영양 연구 단지(800 m²)이며, 완전 통제 무작위 대조 시험을 수행할 수 있는 국내 몇 안 되는 시설 중 하나입니다. 여기에는 대사 부엌, 카페테리아, 생물학적 표본 수집 공간, 식이 평가, 참가자 무작위 배정 및 관리를 위한 e-플랫폼, 대사체학 플랫폼이 있습니다. 전임 연구 간호사가 상주합니다. ULaval의 데이터 센터는 안전한 저장 및 분석 능력을 보장합니다. 이 최첨단 인프라는 프로젝트의 성공에 핵심적입니다.

대사체학 프로파일링: 시험이 완료되면, 혈장 샘플은 INAF 대사체학 플랫폼에서 4가지 상호 보완적인 LC 방법(양이온 및 음이온 전자분무 이온화)을 사용하여 처리되어 약 22,000개의 대사체의 상대적 풍부도를 결정할 것입니다. 여기에는 아미노산, 당류, 작은 유기산(BEH Amide); 폴리페놀 대사체 및 작은 펩타이드(HSS T3); 유리 지방산 및 담즙산(CSH C18); 지질(BEH C8)이 포함됩니다. 혈장 샘플 외에도, 우리는 4가지 요구르트 각각과 대두 푸딩의 샘플도 처리할 것입니다. 대사체학 프로파일링은 방법에 따라 Thermo Vanquish U-HPLC와 Thermo Fusion Tribrid Orbitrap 질량 분석기가 결합된 시스템 또는 Waters Acquity I-Class UPLC와 Waters Synapt G2-Si가 결합된 시스템을 사용하여 수행될 것입니다. 원시 데이터는 Compound Discoverer와 Progenesis QI를 사용하여 처리될 것입니다. 대사체 식별은 지속적으로 성장하는 INAF 분석 표준 은행(n=1,000 화합물, 예: 아미노산, 장 유래 대사체, 담즙산, 페놀 화합물, 지방산)을 사용하여 수행될 것입니다. 관심 있는 추가 크로마토그래피 피크는 여러 스펙트럼 및 분자 데이터베이스(예: mzCloud, HMDB)를 사용하여 추정 식별을 거칠 것입니다. 대사체학 프로파일링은 1개월이 소요될 것으로 예상됩니다.

통계 분석: 1단계: 요구르트 섭취의 잠재적 바이오마커 식별. 이를 위해, 우리는 요구르트 함유 식단과 무요구르트 식단을 구별할 수 있는 모든 대사체를 식별하는 것을 목표로 합니다. 독립 변수에는 본 시험의 각 참가자로부터 네 번의 중재 후 측정된 모든 대사체(n=22,000)의 상대적 풍부도가 포함되며, 이 중 80개는 무요구르트입니다. 또한 우리의 이전 우유 및 치즈 바이오마커 연구(n=284 무요구르트 혈장 샘플, 동일한 대사체학 방법으로 처리; 총=604)의 데이터도 포함됩니다. 종속 변수는 "식단 내 요구르트 존재 여부"(예/아니오)입니다. 우리는 분류 모델을 훈련하기 위해 극한 그래디언트 부스팅 알고리즘(XGBoost)을 사용할 것입니다 [42]. 반복 과정이 n번 반복될 것입니다: (1) 모델 훈련, (2) 순열 검정으로 계산된 최고 예측 능력을 가진 대사체 식별, (3) 다음 반복 전에 이 대사체 제거. 각 반복에 대해, 참가자를 훈련 세트(80%; n=484 관측치)와 테스트 세트(20%; n=120)로 다른 분할을 사용하여 25개의 모델이 훈련될 것입니다. 반복은 모델의 민감도 또는 특이도 95% 신뢰 구간이 0.5(분류 알고리즘의 무효 예측력)에 도달할 때까지 계속될 것입니다. 이 단계가 끝나면, 제거된 n개의 대사체가 요구르트 섭취의 잠재적 바이오마커 풀을 구성하며, 이는 후속 단계를 위해 유지될 것입니다. 후속 단계는 FoodBALL이 제안한 검증된 식품 섭취 바이오마커의 주요 특성을 테스트하기 위해 표준 통계적 접근법을 활용할 것입니다. 달리 명시되지 않는 한, 다음의 모든 검정은 대사체 상대적 풍부도를 종속 변수로 하는 반복 측정을 위한 혼합 모델을 사용하여 수행될 것입니다. 모델은 연령, 성별, 체질량지수, 식단의 일일 총 열량으로 조정될 것입니다.

2단계, 조잡한 용량-반응성: 우리는 무요구르트 및 요구르트 함유 식단 후 각 잠재적 바이오마커의 상대적 풍부도를 비교할 것입니다. 요구르트 섭취와 함께 풍부도가 증가하는 대사체만 다음 단계로 진행할 것입니다.

3단계, 정제된 용량-반응성: 우리는 연구에서 테스트된 세 가지 요구르트 섭취 수준에 걸쳐 대사체의 상대적 풍부도를 비교할 것입니다. 무요구르트 식단을 0으로 코딩했을 때 유의한 선형 경향을 보이는 대사체가 유지될 것입니다.

4단계, 시간-반응성: 급성 테스트 식사 동안 수집된 혈장 샘플 데이터를 사용하여, 우리는 대사체의 상대적 풍부도가 시간에 따라 증가하는지 평가할 것입니다. 요구르트 섭취 후 대두 기반 푸딩과 비교하여 더 큰 곡선 아래 면적(AUC)을 가진 대사체가 유지될 것입니다.

5단계, 특이성: 요구르트에 대한 특이성을 확인하기 위해, 대사체는 요구르트와 함께 증가하지만 우유나 치즈와 함께 증가하지 않아야 합니다. 이를 테스트하기 위해, 우리는 Drouin-Chartier 교수가 보유한 이전 DFC 보조금에서 생성된 대사체학 데이터를 사용할 것입니다. 이전 프로젝트에서, 4주에서 6주 동안 우유 또는 치즈 섭취가 심혈관 대사 위험 요인에 미치는 영향을 평가하기 위해 수행된 4개의 이전 교차 무작위 대조 시험에서 수집된 혈장 샘플이 우유 및 치즈 섭취의 대사체 바이오마커를 별도로 식별하는 데 사용되었습니다. 이 데이터 세트는 118명의 개인에 대한 완전 통제 우유- 또는 치즈 함유 식단과 무유제품 식단의 대사체학 데이터를 포함합니다. 우유나 치즈에 의해 풍부도가 증가하지 않는 대사체가 이 단계 끝에 유지될 것입니다. 이는 추가 비용 없이 수행될 것입니다.

6단계, 견고성: 우리는 또한 우리의 과거 DFC 보조금에서 생성된 대사체학 데이터를 사용할 것입니다. 이는 공복 혈장 샘플을 제공하고 혈장 샘플링 전주에 세 번의 24시간 식이 회상(R24W)을 완료한 200명의 성인 코호트에서 나올 것이며, 이 중 하나는 혈장 샘플링 전날의 식이 섭취를 보고합니다. 참가자는 중위수 요구르트 섭취로 나뉠 것입니다. 중위수 이상의 참가자에서 더 큰 풍부도를 가진 대사체만 유지될 것입니다. 이 단계 또한 추가 비용이 발생하지 않을 것입니다.

7단계, 타당성: 우리는 유지된 대사체가 그 성질과 화학 구조를 기반으로 요구르트에서 유래한 것인지 평가할 것이며, 우유 성분 데이터베이스를 사용할 것입니다. 또한, 우리는 이러한 대사체를 네 가지 테스트된 요구르트의 대사체학 프로파일과 비교할 것입니다. 이 단계 이후, 유지된 대사체는 이미 검증된 요구르트 섭취 바이오마커로 간주되기 위한 FoodBALL의 필수 기준을 충족했을 것입니다. 요구르트의 독특한 매트릭스 특성을 고려할 때, 우리는 모든 기준을 충족하는 최소 하나의 대사체를 식별할 것이라고 확신합니다. 우리의 이전 작업에서, 우리는 우유 섭취에 대한 하나의 바이오마커(델타-발레로베타인, 우유 특이 성분)와 치즈 섭취에 대한 아홀 가지 다른 바이오마커를 성공적으로 식별했습니다.

성능 평가: 우리는 먼저 식별된 바이오마커의 상대적 풍부도와 시험 동안 참가자에게 제공된 알려진 요구르트 섭취 수준을 상호 참조하여 요구르트 섭취를 추정하는 모델을 훈련할 것입니다. 이는 바이오마커를 기반으로 식품 섭취를 모델링하기 위해 특별히 개발된 Multimarker 알고리즘을 사용하여 수행될 것입니다 [43, 44]. 모델은 보정 방정식을 생성할 것이며, 우리는 이를 사용하여 24시간 식이 회상 데이터를 보정하고 바이오마커 보정 요구르트 섭취 추정치를 생성할 것입니다. 다음으로, 우리는 다음을 사용하여 얻은 요구르트 섭취 추정치의 정확성을 평가할 것입니다: a) 보정 방정식(바이오마커만), b) 보정된 24시간 식이 회상(바이오마커 × 자가 보고 섭취), c) 비보정 24시간 식이 회상(자가 보고 섭취만), 각각을 연구 메뉴에서 제공된 실제 섭취량과 비교함으로써. 우리는 피어슨 상관 계수와 그들의 95% 신뢰 구간을 방법 간에 t-검정을 사용하여 비교할 것입니다.