Identificatie van objectieve op metabolomica gebaseerde biomarkers van yoghurtconsumptie (YOGBIO)

De Amerikaanse Food and Drug Administration heeft onlangs de wetenschappelijke bewijslast voldoende robuust geacht om een verzoek voor een gekwalificeerde gezondheidsclaim over yoghurt en verminderd risico op diabetes type 2 (T2D) goed te keuren. Daarentegen heeft Health Canada een soortgelijke claim nog niet goedgekeurd. Het bestaande bewijs is uitsluitend afkomstig van prospectieve cohortstudies die gebaseerd zijn op zelfgerapporteerde voedingsvragenlijsten, die – ondanks validatie – onderhevig zijn aan willekeurige en systematische fouten die de bewijskwaliteit kunnen aantasten en regelgevende goedkeuring kunnen belemmeren.

Biomarkers van voedselinname worden steeds meer erkend als waardevolle instrumenten om de objectiviteit in de voedings-epidemiologie te vergroten. Metabolomics, de uitgebreide profilering van plasmametabolieten, wordt beschouwd als de gouden standaard voor het identificeren van dergelijke biomarkers. In de context van zuivel was een belangrijke mijlpaal de identificatie van een metabolomische signatuur van yoghurtinname in een grote Spaanse cohortstudie. Deze signatuur – bestaande uit 27 metabolieten (bijv. C14:0-sfingomyeline, afgeleid van myristinezuur) – voorspelde yoghurtinname in een onafhankelijke Amerikaanse cohortstudie en was geassocieerd met een lagere T2D-incidentie in beide populaties. Omdat deze signatuur echter afkomstig was van observationele gegevens, ontbrak specificiteit voor yoghurtinname.

Dit project probeert deze kritieke leemte op te vullen door specifieke biomarkers van yoghurtinname te ontdekken en deze te valideren volgens erkende criteria.

We zullen een gerandomiseerde, cross-over, dosis-respons voedingsstudie uitvoeren met 16 over het algemeen gezonde volwassenen (8 vrouwen, 8 mannen). De studie zal bestaan uit 4 vooraf bepaalde diëten, elk van 7 dagen en gescheiden door een 1-weekse wash-outperiode. Op de 7e dag van elk dieet zullen deelnemers bij INAF een gemengde maaltijdtest ondergaan om plasmonsters in postprandiale toestand te verzamelen. De 4 diëten zullen gebaseerd zijn op een zuivelvrij achtergronddieet dat een hoge naleving van de Canadese voedingsgids weerspiegelt, met de volgende toevoegingen:

1. 125 g per 2.380 kcal per dag van een sojapudding (d.w.z. yoghurtvrij dieet);
2. 90 g per 2.380 kcal per dag yoghurt (d.w.z. 0,5 referentieportie yoghurt per 2.380 kcal per dag);
3. 175 g per 2.380 kcal per dag yoghurt (d.w.z. 1 referentieportie yoghurt per 2.380 kcal per dag);
4. 350 g per 2.380 kcal per dag yoghurt (d.w.z. 2 referentieporties per 2.380 kcal per dag).

Om ervoor te zorgen dat de geïdentificeerde biomarkers de diversiteit van yoghurts weerspiegelen, zullen vier yoghurtvarianten worden getest:

a) vetvrije gewone naturel yoghurt; b) gewone naturel yoghurt met 2% melkvet; c) vetvrije Griekse naturel yoghurt; d) Griekse naturel yoghurt met 2% melkvet. Elk yoghurttype zal aan vier deelnemers worden toegewezen, die hetzelfde type consistent gedurende de studie zullen consumeren. Het doel is niet om een aparte biomarker voor elk yoghurttype te identificeren, maar om ervoor te zorgen dat de geïdentificeerde biomarker(s) rekening houden met de diversiteit van yoghurttypen. Voor de yoghurtvrije interventie zullen alle deelnemers dezelfde sojapudding consumeren. Deelnemers zullen de vier 7-daagse interventies in willekeurige volgorde voltooien. Dit ontwerp zorgt ervoor dat eventuele waargenomen variaties in het plasmametaboloom uitsluitend aan yoghurt kunnen worden toegeschreven.

Tijdens alle vier interventies zullen alle maaltijden en voedingsmiddelen worden verstrekt met behulp van een 7-daags cyclisch menu, zoals eerder gedaan door ons team [28-30]. Het achtergronddieet voor elke interventie zal identiek zijn, zuivelvrij (d.w.z. exclusief alle zuivel en boter), en ontworpen om een hoge naleving van de Canadese voedingsgids te weerspiegelen, met nadruk op minimaal bewerkte plantaardige voedingsmiddelen. Om de acceptatie en naleving te vergroten, zal het menu dagelijks ten minste één recept uit de officiële Canadese voedingsgidsdocumentatie bevatten [31, 32]. Een ervaren voedingsdeskundige zal de diëten bereiden, waarbij alle voedingsmiddelen en ingrediënten nauwkeurig tot op 0,1 g worden afgewogen. In de context van het identificeren van innamebiomarkers werd natuur yoghurt als de meest geschikte keuze beschouwd in plaats van gearomatiseerde yoghurt. Echter, natuur yoghurt is minder smakelijk vanwege de zure smaak. Om dit aan te pakken, zal het achtergronddieet een dagelijkse portie klein fruit bevatten die deelnemers zullen worden geïnstrueerd om ofwel door de yoghurt (of sojapudding) te mengen of ernaast te consumeren. Aangezien de fruitportie gestandaardiseerd is en in consistente hoeveelheden elke dag wordt geconsumeerd tijdens de vier interventies, zal dit geen verwarring veroorzaken in het identificatieproces van yoghurtbiomarkers. We beschouwen deze aanpak ook als gunstig om de naleving tijdens het dieet met sojapudding te waarborgen.

Over de vier yoghurttypen en drie inname-niveaus zal yoghurt gemiddeld 120 kcal/dag bijdragen, net als de controle-sojapudding. De laagste calorische bijdrage zal 40 kcal zijn (vetvrije gewone natuur yoghurt, 90 g/dag), en de hoogste zal 240 kcal zijn (Griekse natuur yoghurt met 2% melkvet; 350 g/dag). Deze calorieën worden toegevoegd aan een achtergronddieet van 2.380 kcal/dag om een gestandaardiseerd menu te creëren dat gemiddeld 2.500 kcal/dag zal bedragen over de vier interventies. Aangezien de interventies slechts zeven dagen duren, is het onwaarschijnlijk dat het verschil in calorische bijdrage van de yoghurts of sojapudding het lichaamsgewicht zal beïnvloeden of verwarring zal veroorzaken. De voorgestelde aanpak – het toevoegen van de geteste voedingsmiddelen aan een identiek iso-energetisch achtergronddieet – is de optimale strategie. Voor een enkele deelnemer zal het enige verschil tussen de vier diëten het yoghurtgehalte zijn, waardoor eventuele verschillen in het plasmametaboloom na het dieet uitsluitend aan yoghurt kunnen worden toegeschreven. Als we daarentegen een vergelijkbaar totaal calorisch gehalte van het achtergronddieet in de vier fasen zouden handhaven, zouden aanpassingen aan het achtergronddieet nodig zijn, wat bias in het plasmametaboloom zou introduceren. Bij aanvang zullen de energiebehoeften van de deelnemers worden geschat met gevalideerde voorspellende vergelijkingen [33], en het totale energiegehalte van de diëten zal dienovereenkomstig worden aangepast om aan deze behoeften te voldoen.

Tijdens elk van de vier 7-daagse interventies moeten deelnemers ten minste drie volledige maaltijden bij INAF consumeren onder toezicht van de klinisch onderzoekscoördinator (KOC). Tijdens deze bezoeken ontvangen ze ook hun maaltijden voor de komende 24 tot 72 uur. Deelnemers zullen worden geïnstrueerd om alleen de verstrekte voedingsmiddelen te consumeren en alle maaltijden zoals aangeleverd te consumeren. Alcohol, vitaminesupplementen en natuurlijke gezondheidsproducten zijn niet toegestaan. Thee en koffie (≤2 kopjes/dag) zijn toegestaan, zonder dagelijkse schommelingen en zonder melk, room of suiker. Een onbeperkte hoeveelheid water is toegestaan. Deelnemers zullen worden geïnstrueerd om hun gebruikelijke fysieke activiteitenniveau stabiel te houden gedurende het hele protocol. Op de 7e dag van elk dieet zullen deelnemers een acute gemengde maaltijdtest ondergaan om informatie te verkrijgen over de tijdsresponsiviteit van de yoghurtbiomarkers. Na een 12 uur durend vasten komen deelnemers om 7:30 uur bij INAF aan. De testmaaltijd zal bestaan uit een ontbijtsmoothie die dezelfde yoghurt (of sojapudding) bevat die dagelijks in de voorgaande dagen is verstrekt. Plasmonsters worden verzameld op baseline (nuchter) en 1, 2, 4 en 6 uur na de maaltijd. Monsters worden afgenomen in EDTA-buizen en opgeslagen bij -80°C.

Tijdens de test zullen deelnemers worden geïnstrueerd om een gevalideerde zelf-ingevulde webgebaseerde 24-uurs voedingsrecall (de R24W) in te vullen, specifiek gevalideerd voor onderzoek onder volwassenen in Quebec [34-40]. De volledige methodologie en validatie achter de R24W is gepubliceerd [34-40]. Kortom, de R24W leidt deelnemers om alle voedingsmiddelen en dranken, inclusief alcohol, die de vorige dag zijn geconsumeerd, aan te geven. De R24W maakt het mogelijk om geconsumeerde voedingsmiddelen en dranken te selecteren door te bladeren door een gestructureerde lijst van voedingsmiddelen of door een zoekmachine te gebruiken. Het bevat ook gestandaardiseerde afbeeldingen om de grootte van porties te helpen beoordelen. Deze gegevens zullen worden gebruikt om de prestaties van de R24W te vergelijken met die van de yoghurtbiomarkers bij het schatten van het werkelijke yoghurtgehalte van het dieet.

Deelnemers en de KOC kunnen niet geblindeerd worden voor dieettoewijzing. De exacte hoeveelheid yoghurt (of sojapudding) in de diëten zal echter niet aan deelnemers worden bekendgemaakt. De vier diëten zullen willekeurig worden gelabeld met letters (bijv. A=hoge yoghurt, B=soja, C=lage yoghurt, D=matige yoghurt). Deze aanpak zal informatiebias minimaliseren voor het invullen van de R24W aan het einde van elke interventie. Elke interventie wordt gescheiden door een 1-weekse wash-outperiode, om deelnemers een pauze te geven, waardoor het risico op uitval geassocieerd met een meerweekse interventie wordt verminderd. Tijdens de wash-out worden deelnemers geïnstrueerd om terug te keren naar hun gebruikelijke dieet. We verwachten geen carry-over effecten van het dieet tijdens de wash-out op de daaropvolgende 7-daagse interventieperioden met betrekking tot de identificatie van yoghurtinnamebiomarkers. Inderdaad, de identificatie van yoghurtinnamebiomarkers maakt gebruik van de plasmonsters die op dag zeven van elke interventie zijn verzameld, zowel in nuchtere als postprandiale toestand. Het is dus zeer onwaarschijnlijk dat een biomarker van voedsel geconsumeerd tijdens de wash-outperiode de acute postprandiale responsiviteit vertoont die verwacht wordt voor de yoghurtinnamebiomarker onder het voorgestelde ontwerp [27]. De totale studiedeelname zal 7 weken duren. Aan het einde van de studie zullen we voor elke deelnemer in totaal 15 plasmonsters hebben verzameld na yoghurtconsumptie (d.w.z. 5 monsters × 3 niveaus van yoghurtinname) en 5 monsters verzameld na het yoghurtvrije dieet, voor een totaal van 240 post-yoghurtmonsters en 80 zonder yoghurt (totaal=320).

Naleving en verwachte uitval: Er wordt een checklist verstrekt om de dagelijkse voedselconsumptie bij te houden. Het consumeren van 3 volledige maaltijden bij INAF onder toezicht van de KOC zal de naleving van het protocol versterken. In onze eerdere studies met vergelijkbare ontwerpen werd 99% van de verstrekte voedingsmiddelen geconsumeerd [28, 29], met alleen anekdotische afwijkingen, allemaal zelf gerapporteerd. Prof. Drouin-Chartier ontwikkelde en gebruikte oorspronkelijk hetzelfde 7-daagse menu binnen een CIHR-gefinancierde volledig gevoede RCT bij 50 volwassenen met heterozygote familiale hypercholesterolemie, met interventies van 4 weken. De naleving was >99% en het dieet werd zeer gewaardeerd, zonder verschillen tussen vrouwelijke en mannelijke deelnemers. We hebben eerder volledig gecontroleerde voedings-RCT's van langere duur uitgevoerd (bijv. 5×4 weken of 3×6 weken) met meer invasieve procedures (bijv. darmbiopsies) en diëten die minder typisch zijn voor Canadese gewoonten (bijv. Mediterraan, zuivelvrij), maar uitvalpercentages overschreden nooit 20% [28, 29, 41]. De wash-outperioden verlagen het uitvalrisico. We verwachten geen nalevingsproblemen. We hebben gepland om 20 deelnemers in te schrijven, waarbij we verwachten dat minstens 16 het volledige protocol zullen voltooien.

Wervingsprocedures: Inclusiecriteria: leeftijd: 18-70 jaar; BMI: 18-40 kg/m²; bereidheid om dagelijks natuur yoghurt te consumeren gedurende 3 weken; voor koffie/theeconsumenten, bereidheid om deze dranken te consumeren zonder toegevoegde melk, room of suiker gedurende 4 weken. Exclusiecriteria: lactose-intolerantie; bloeddonatie binnen 2 maanden; ernstige chronische ziekte of lopende behandeling voor aandoeningen zoals infecties, auto-immuunziekten, kanker, diabetes type 2, ziekte van Crohn, coeliakie, lever- of nierziekten; geschiedenis van ernstige kanker, cardiovasculaire ziekte of bariatrische chirurgie; onstabiel lichaamsgewicht gedurende 3 maanden; illegaal drugsgebruik of alcoholisme; roken/vapen van tabak/cannabis (om ervoor te zorgen dat er geen dag-tot-dag schommelingen zijn en objectieve rapportage van consumptie is te complex); allergieën of aversies voor componenten van de diëten. Deelnemers worden geworven uit het Quebec City-gebied via massamails van INAF (bereik: >5.000) en Université Laval (>20.000). Geïnteresseerde personen worden uitgenodigd om contact op te nemen met de KOC voor een screeningtelefoongesprek. Geschikte personen worden vervolgens uitgenodigd voor een persoonlijke informatiebijeenkomst, waar de volledige details van het protocol worden uitgelegd. Geïnteresseerden wordt gevraagd om geïnformeerde toestemming te geven. Daarna worden deelnemers gerandomiseerd en wordt een baselinebezoek gepland. Er worden in totaal 10 verschillende randomisatiesequenties gegenereerd met behulp van William's ontwerp om ervoor te zorgen dat elke behandeling elke andere behandeling een gelijk aantal keer volgt. Elke sequentie wordt toegewezen aan een enkele deelnemer, op geslachtsspecifieke wijze. We verwachten dat de studie 20 weken zal duren om te voltooien. INAF herbergt de grootste klinische voedingsonderzoeksunit van Canada (800 m²), en een van de weinige faciliteiten in het land die volledig gecontroleerde RCT's kan uitvoeren. Het beschikt over een metabole keuken, cafetaria, ruimtes voor het verzamelen van biologische monsters, een e-platform voor voedingsbeoordeling, deelnemersrandomisatie en -beheer, en een metabolomicsplatform. Er is een fulltime onderzoeksverpleegkundige in dienst. Het datacenter van ULaval zorgt voor veilige opslag en analytische capaciteit. Deze state-of-the-art infrastructuur is essentieel voor het succes van het project.

Metabolomics profilering: Zodra de studie is voltooid, worden plasmonsters verwerkt op het metabolomicsplatform van INAF met behulp van vier complementaire LC-methoden (positieve en negatieve elektrospray-ionisatie) om de relatieve abundantie van ~22.000 metabolieten te bepalen. Deze omvatten aminozuren, suikers en kleine organische zuren (BEH Amide); polyfenolmetabolieten en kleine peptiden (HSS T3); vrije vetzuren en galzuren (CSH C18); en lipiden (BEH C8). Naast plasmonsters zullen we ook monsters van elk van de 4 yoghurts en de sojapudding verwerken. Metabolomics profilering wordt uitgevoerd met een Thermo Vanquish U-HPLC gekoppeld aan een Thermo Fusion Tribrid Orbitrap massaspectrometer of een Waters Acquity I-Class UPLC gekoppeld aan een Waters Synapt G2-Si, afhankelijk van de methode. Ruwe gegevens worden verwerkt met Compound Discoverer en Progenesis QI. Metabolietidentificatie wordt uitgevoerd met behulp van de steeds groeiende INAF-analytische standaardenbank (n=1.000 verbindingen, bijv. aminozuren, darm-afgeleide metabolieten, galzuren, fenolische verbindingen, vetzuren). Aanvullende chromatografische pieken van interesse ondergaan putatieve identificatie met behulp van meerdere spectrale en moleculaire databases (bijv. mzCloud, HMDB). De metabolomics profilering wordt verwacht 1 maand te duren.

Statistische analyses: Stap 1: identificatie van potentiële biomarkers van yoghurtinname. Hiervoor willen we alle metabolieten identificeren die onderscheid mogelijk maken tussen een yoghurtbevattend en een yoghurtvrij dieet. Onafhankelijke variabelen omvatten de relatieve abundantie van alle metabolieten (n=22.000) gemeten na elk van de vier interventies, waarbij plasmonsters voor elke deelnemer uit de huidige studie worden overwogen (320 observaties, waarvan 80 yoghurtvrij), en uit onze eerdere melk- en kaasbiomarkerstudie (n=284 yoghurtvrije plasmonsters, verwerkt met dezelfde metabolomics methoden; totaal=604). De afhankelijke variabele is "aanwezigheid van yoghurt in het dieet" (ja/nee). We gebruiken het extreme gradient boosting-algoritme (XGBoost) om classificatiemodellen te trainen [42]. Een iteratief proces wordt n keer herhaald: (1) trainen van de modellen, (2) identificeren van de metaboliet met het beste voorspellend vermogen, berekend door permutatietesten, en (3) verwijderen van deze metaboliet voor de volgende iteratie. Voor elke iteratie worden 25 modellen getraind met behulp van verschillende splitsingen van deelnemers in trainingssets (80%; n=484 observaties) en test sets (20%; n=120). De iteraties gaan door totdat het 95% betrouwbaarheidsinterval voor sensitiviteit of specificiteit van de modellen 0,5 bereikt (nul voorspellend vermogen van een classificatie-algoritme). Aan het einde van deze stap vormen de n verwijderde metabolieten de pool van potentiële biomarkers van yoghurtinname, die worden behouden voor volgende stappen. De volgende stappen maken gebruik van standaard statistische benaderingen om de belangrijkste kenmerken van een gevalideerde biomarker van voedselinname te testen, zoals voorgesteld door FoodBALL. Tenzij anders vermeld, worden alle volgende tests uitgevoerd met gemengde modellen voor herhaalde metingen, met relatieve metabolietabundantie als afhankelijke variabele. De modellen worden gecorrigeerd voor leeftijd, geslacht, body mass index en totale dagelijkse calorieën uit het dieet.

Stap 2, ruwe dosis-responsiviteit: We vergelijken de relatieve abundantie van elke potentiële biomarker na yoghurtvrije en yoghurtbevattende diëten. Alleen metabolieten waarvan de abundantie toeneemt met yoghurtconsumptie gaan door naar de volgende stap.

Stap 3, verfijnde dosis-responsiviteit: We vergelijken de relatieve abundantie van metabolieten over de drie geteste niveaus van yoghurtinname in de studie. Metabolieten die een significante lineaire trend vertonen, met het yoghurtvrije dieet gecodeerd als 0, worden behouden.

Stap 4, tijd-responsiviteit: Met behulp van gegevens van plasmonsters verzameld tijdens de acute testmaaltijd beoordelen we of de relatieve abundantie van metabolieten in de loop van de tijd toeneemt. Metabolieten met een groter gebied onder de curve (AUC) na yoghurtinname vergeleken met de sojapudding worden behouden.

Stap 5, specificiteit: Om specificiteit voor yoghurt te bevestigen, moeten metabolieten een verhoogde abundantie vertonen met yoghurt maar niet met melk of kaas. Om dit te testen, gebruiken we metabolomics-gegevens gegenereerd uit het vorige DFC-subsidie van prof. Drouin-Chartier. In dit eerdere project werden plasmonsters verzameld uit 4 eerder uitgevoerde cross-over RCT's met volledig gevoede settings die gericht waren op het evalueren van de impact van melk- of kaasinname gedurende 4 tot 6 weken op cardiometabole risicofactoren, gebruikt om metaboliethiomarkers van melk- en kaasinname afzonderlijk te identificeren. Deze dataset bevat metabolomics-gegevens van volledig gecontroleerde melk- of kaasbevattende diëten en een zuivelvrij dieet voor 118 individuen. Metabolieten waarvan de abundantie niet wordt verhoogd door melk of kaas worden aan het einde van deze stap behouden. Dit wordt uitgevoerd zonder extra kosten.

Stap 6, robuustheid: We gebruiken ook metabolomics-gegevens gegenereerd in ons vorige DFC-subsidie. Deze komen uit een cross-sectionele cohortstudie van 200 volwassenen die een nuchter plasmonster hebben verstrekt en drie 24-uurs voedingsrecalls (R24W) hebben ingevuld in de week voorafgaand aan de plasmasampling, waarvan één rapporteert over hun dieetinname de dag voor de plasmasampling. Deelnemers worden verdeeld op mediaan yoghurtinname. Alleen metabolieten met een grotere abundantie in deelnemers boven de mediaan worden behouden. Deze stap brengt ook geen extra kosten met zich mee.

Stap 7, plausibiliteit: We beoordelen de plausibiliteit van de behouden metabolieten als afkomstig van yoghurt op basis van hun aard en chemische structuren, met behulp van de Milk Composition Database. Daarnaast vergelijken we deze metabolieten met de metabolomics-profielen van de vier geteste yoghurts. Na deze stap hebben de behouden metabolieten al voldaan aan de essentiële criteria van FoodBALL om als gevalideerde biomarkers van yoghurtinname te worden beschouwd. Gezien de unieke matrixkenmerken van yoghurt zijn we ervan overtuigd dat we ten minste één metaboliet kunnen identificeren die aan alle criteria voldoet. In ons eerdere werk hebben we met succes één biomarker voor melkinname geïdentificeerd (delta-valerobetaïne, een melkspecifiek bestanddeel) en negen verschillende andere voor kaasinname.

Prestatie-evaluatie: We trainen eerst een model om yoghurtinname te schatten met behulp van de geïdentificeerde biomarkers door hun relatieve abundantie te kruisverwijzen met de bekende yoghurtinname-niveaus die aan deelnemers zijn verstrekt tijdens de studie. Dit gebeurt met het Multimarker-algoritme [43], dat specifiek is ontwikkeld om voedselinname te modelleren op basis van biomarkers [44]. Het model genereert een calibratievergelijking die we gebruiken om 24-uurs voedingsrecall-gegevens te calibreren en biomarker-gecalibreerde schattingen van yoghurtinname te produceren. Vervolgens evalueren we de nauwkeurigheid van yoghurtinname-schattingen verkregen met: a) de calibratievergelijking (alleen biomarkers), b) de gecalibreerde 24-uurs voedingsrecall (biomarkers × zelfgerapporteerde inname), en c) de ongecalibreerde 24-uurs voedingsrecall (alleen zelfgerapporteerde inname), door elk te vergelijken met de werkelijke inname verstrekt in de studiemenu's. We vergelijken Pearson-correlatiecoëfficiënten en hun 95% betrouwbaarheidsintervallen tussen methoden met behulp van t-tests.