Yogurtinkulutuksen objektiivisten metabolomiikkapohjaisten biomarkkerien tunnistaminen (YOGBIO)

Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) totesi äskettäin, että tieteellinen näyttö on riittävän vankka hyväksyäkseen lausunnon jogurtin ja alentuneen tyypin 2 diabeteksen (T2D) riskin välisestä terveysväitteestä. Sen sijaan Health Canada ei ole vielä hyväksynyt vastaavaa väitettä. Olemassa oleva näyttö perustuu yksinomaan prospektiivisiin kohorttitutkimuksiin, jotka nojautuvat itse raportoituihin ravintoaineistokyselyihin. Nämä kyselyt – vaikka validoidutkin – ovat alttiina satunnaisille ja systemaattisille virheille, jotka voivat heikentää näytön laatua ja haitata sääntelyhyväksyntää.

Ruokavalion saantibiomarkkerit tunnistetaan yhä enemmän arvokkaiksi työkaluiksi ravitsemustieteen epidemiologiassa. Metabolomiikka, plasman metaboliittien kattava profilointi, pidetään kultaisena standardina tällaisten biomarkkerien tunnistamisessa. Maitotuotteiden yhteydessä merkittävä virstanpylväs oli jogurtinsaantimetaboliittisignaalin tunnistaminen suuressa espanjalaisessa kohortissa. Tämä signaali, joka sisältää 27 metaboliittia (esim. C14:0 sfingomyeliini, joka on peräisin myristiinihaposta), ennusti jogurtinsaantia itsenäisessä yhdysvaltalaisessa kohortissa ja liittyi alhaisempaan T2D-ilmaantuvuuteen molemmissa väestöissä. Koska tämä signaali johdettiin havainnoinnista, siitä puuttui kuitenkin spesifisyys jogurtinsaannille.

Tämä projekti pyrkii täyttämään tämän kriittisen aukon löytämällä spesifisiä jogurtinsaantibiomarkkereita ja validoimalla ne tunnistettuja kriteerejä vastaan.

Suoritamme satunnaistetun, ristiinaseteltavan, annosvasetutkimuksen, johon osallistuu 16 yleisesti tervettä aikuista (8 naista, 8 miestä). Tutkimus koostuu 4 ennalta määrätystä ruokavalioista, joista kukin kestää 7 päivää ja jotka erotetaan 1 viikon peseytymisjaksolla. Jokaisen ruokavalion 7. päivänä osallistujat suorittavat sekaruokakokeen INAF:ssä kerätäkseen plasmanäytteitä ruokailun jälkeisessä tilassa. 4 ruokavaliota perustuvat maitovapaaseen taustaruokavalioon, joka heijastaa korkeaa noudattamista Kanadan ruokaopasta, seuraavin lisäyksin:

1. 125 g per 2,380 kcal per päivä soijapohjaista vanukasta (eli jogurtiton ruokavalio);
2. 90 g per 2,380 kcal per päivä jogurttia (eli 0,5 viiteannosta jogurttia per 2,380 kcal per päivä);
3. 175 g per 2,380 kcal per päivä jogurttia (eli 1 viiteannos jogurttia per 2,380 kcal per päivä);
4. 350 g per 2,380 kcal per päivä jogurttia (eli 2 viiteannosta per 2,380 kcal per päivä).

Varmistaakseen, että tunnistetut biomarkkerit heijastavat jogurttien monimuotoisuutta, testataan neljää jogurttilajiketta:

a) rasvaton luonnonjogurtti; b) 2% rasvapitoinen luonnonjogurtti; c) rasvaton luonnongreikkalainen jogurtti; d) 2% rasvapitoinen luonnongreikkalainen jogurtti. Jokainen jogurttityyppi määrätään neljälle osallistujalle, jotka kuluttavat samaa tyyppiä johdonmukaisesti koko tutkimuksen ajan. Tavoitteena ei ole tunnistaa erillistä biomarkkeria kullekin jogurttityypille vaan varmistaa, että tunnistettu(t) biomarkkeri(t) huomioivat jogurttityyppien monimuotoisuuden. Jogurttittomassa interventiossa kaikki osallistujat syövät samaa soijapohjaista vanukasta. Osallistujat suorittavat neljä 7 päivän interventiota satunnaisessa järjestyksessä. Tämä suunnittelu varmistaa, että kaikki havaittavat muutokset plasman metaboloomissa johtuvat yksinomaan jogurtista.

Kaikkien neljän interventioiden aikana kaikki ateriat ja ruoat tarjotaan käyttäen 7 päivän syklistä ruokalistaa, kuten tiimimme on aiemmin tehnyt [28-30]. Taustaruokavalio kussakin interventiossa on identtinen, maitovapaa (eli ei sisällä maitotuotteita tai voita) ja suunniteltu heijastamaan korkeaa noudattamista Kanadan ruokaopasta, painottaen minimaalisesti prosessoituja kasvipohjaisia ruokia. Hyväksyttävyyden ja noudattamisen parantamiseksi ruokalista sisältää päivittäin vähintään yhden reseptin Kanadan ruokaopiston virallisesta dokumentaatiosta [31, 32]. Kokeneen ruokateknikon valmistamat ruokavaliot, joissa kaikki ruoat ja ainesosat punnitaan tarkasti lähimpään 0,1 g. Saantibiomarkkerien tunnistamisen yhteydessä luonnonjogurtti todettiin sopivimmaksi valinnaksi maustetun jogurtin sijaan. Luonnonjogurtti on kuitenkin vähemmän maukas happaman maunsa vuoksi. Tämän ratkaisemiseksi taustaruokavalio sisältää päivittäisen annoksen pieniä hedelmiä, joita osallistujia ohjeistetaan joko sekoittamaan jogurttiin (tai soijavanukkaaseen) tai syömään sen kanssa. Koska hedelmäannos standardoidaan ja kulutetaan samassa määrin joka päivä kaikissa neljässä interventiossa, se ei aiheuta sekoittavia tekijöitä jogurttibiomarkkerien tunnistamisessa. Pidämme tätä lähestymistapaa myös suotuisana varmistamaan noudattamisen soijavanukkaa sisältävän ruokavalion aikana.

Neljän jogurttityypin ja kolmen saantitason yli jogurtti tuo keskimäärin 120 kcal/päivä, kuten myös kontrollisoijavanukas. Alhaisin energian tuotto on 40 kcal (rasvaton luonnonjogurtti, 90 g/päivä) ja korkein 240 kcal (2% rasvapitoinen luonnongreikkalainen jogurtti; 350 g/päivä). Nämä kalorit lisätään 2,380 kcal/päivä taustaruokavalioon luodakseen standardoidun ruokalistan, joka keskiarvona on 2,500 kcal/päivä neljän interventioiden yli. Koska interventiot kestävät vain seitsemän päivää, on epätodennäköistä, että jogurttien tai soijavanukkaan kalorituoton ero vaikuttaisi painoon tai aiheuttaisi sekoittavia tekijöitä. Ehdotettu lähestymistapa – testattujen ruokien lisääminen identtiseen isoenergeettiseen taustaruokavalioon – on optimaalinen strategia. Yksittäiselle osallistujalle ainoa ero neljän ruokavalion välillä on jogurtin sisältö, varmistaen, että kaikki ruokavalion jälkeiset erot plasman metaboloomissa johtuvat yksinomaan jogurtista. Jos taas valitsisimme pitää taustaruokavalion kokonaisenergiasisältö samana kaikissa vaiheissa, taustaruokavalioon tarvittaisiin muutoksia, mikä aiheuttaisi harhaa plasman metaboloomissa. Alussa osallistujien energiantarve arvioidaan validoitujen ennusteyhtälöiden avulla [33], ja ruokavalioiden kokonaisenergiasisältö säädetään vastaavasti täyttämään nämä vaatimukset.

Jokaisen neljän 7 päivän interventioiden aikana osallistujien tulee kuluttaa vähintään kolme täyttä ateriaa INAF:ssä kliinisen tutkimuskoordinaattorin (CRC) valvonnassa. Näiden vierailujen aikana he saavat myös ateriansa seuraavalle 24-72 tunnille. Osallistujia ohjeistetaan syömään vain tarjottuja ruokia ja kuluttamaan kaikki ateriat sellaisina kuin ne on toimitettu. Alkoholi, vitamiinilisät ja luontaisterveystuotteet eivät ole sallittuja. Tee ja kahvi (≤2 kuppia/päivä) sallitaan, ilman päivittäisiä vaihteluita ja ilman maitoa, kermaa tai sokeria. Rajoittamaton määrä vettä sallitaan. Osallistujia ohjeistetaan pitämään tavanomainen fyysinen aktiivisuustasonsa vakiona koko protokollan ajan. Jokaisen ruokavalion 7. päivänä osallistujat suorittavat akuutin sekaruokakokeen selvittääkseen jogurttibiomarkkerien aikavasteisuuden. 12 tunnin paaston jälkeen osallistujat saapuvat INAF:ään klo 7.30. Testiateria koostuu aamupalasmoothiesta, joka sisältää saman jogurtin (tai soijavanukkaan) kuin edellisinä päivinä päivittäin tarjottiin. Plasmanäytteitä kerätään alussa (paasto) ja 1, 2, 4 ja 6 tuntia aterian jälkeen. Näytteet kerätään EDTA-putkiin ja varastoidaan -80°C.

Testin aikana osallistujia ohjeistetaan täyttämään validoitu itse hallittu verkkopohjainen 24 tunnin ruokavaliomuistutus (R24W), joka on erityisesti validoitu tutkimukseen Quebecin aikuisten keskuudessa [34-40]. R24W:n täysi metodologia ja validointi on julkaistu [34-40]. Lyhyesti, R24W ohjaa osallistujia ilmoittamaan kaikki edellisenä päivänä kulutetut ruoat ja juomat, mukaan lukien alkoholi. R24W mahdollistaa kulutettujen ruokien ja juomien valitsemisen selaten rakennettua ruokalistaa tai käyttämällä hakukonetta. Se sisältää myös standardoituja kuvia osioiden koon arvioinnin apuna. Näitä tietoja käytetään vertaamaan R24W:n suorituskykyä jogurttibiomarkkerien suorituskykyyn arvioitaessa ruokavalion todellista jogurttisisältöä.

Osallistujat ja CRC eivät voi olla sokaisettuja ruokavalion allokaatioon. Tarkka jogurtin (tai soijavanukkaan) määrä ruokavalioissa ei kuitenkaan paljasteta osallistujille. Neljä ruokavaliota merkitään satunnaisesti kirjaimilla (esim. A=korkea jogurtti, B=soija, C=matala jogurtti, D=kohtalainen jogurtti). Tämä lähestymistapa minimoi informaatiobiasin R24W:n täyttämisessä kunkin interventio lopussa. Jokainen interventio erotetaan 1 viikon peseytymisjaksolla, antaen osallistujille tauon ja vähentäen moniviikkoisen interventioon liittyvän keskeyttämisriskin. Peseytymisjakson aikana osallistujia ohjeistetaan palaamaan tavalliseen ruokavalioonsa. Emme odota ruokavalion siirtymävaikutuksia peseytymisjakson aikana seuraaviin 7 päivän interventiojaksoihin jogurttinsaantibiomarkkerien tunnistamisen suhteen. Todellakin, jogurttinsaantibiomarkkerin tunnistaminen hyödyntää plasmanäytteitä, jotka kerätään kunkin interventio seitsemäntenä päivänä, sekä paasto- että ruokailun jälkeisessä tilassa. Siten on erittäin epätodennäköistä, että peseytymisjakson aikana kulutetusta ruoasta peräisin oleva biomarkkeri osoittaisi akuuttia ruokailun jälkeistä vasteisuutta, jota odotetaan jogurttinsaantibiomarkkerilta ehdotetussa suunnitelmassa [27]. Kokonaistutkimusosallistuminen on 7 viikkoa. Tutkimuksen lopussa jokaiselle osallistujalle meillä on yhteensä 15 plasmanäytettä kerättynä jogurtin kulutuksen jälkeen (eli 5 näytettä x 3 jogurttinsaantitasoa) ja 5 näytettä kerättynä jogurttittoman ruokavalion jälkeen, yhteensä 240 jogurtin jälkeistä näytettä ja 80 ilman jogurttia (yhteensä=320).

Noudattaminen ja odotetut keskeytykset: Päivittäistä ruokakulutusta seurataan tarjottavalla tarkistuslistalla. 3 täyden aterian kuluttaminen INAF:ssä CRC:n valvonnassa vahvistaa protokollan noudattamista. Aikaisemmissa tutkimuksissamme vastaavilla suunnitelmilla 99% tarjotuista ruoista kulutettiin [28, 29], vain anekdoottisilla poikkeamilla, kaikki itse raportoituina. Prof. Drouin-Chartier kehitti ja käytti alun perin samaa 7 päivän ruokalistaa CIHR-rahoitetussa täysin ruokittavassa RCT:ssä 50 aikuisella, joilla oli heterotsygoottinen perinnöllinen hyperkolesterolemia, ja interventiot kestivät 4 viikkoa. Noudattaminen oli >99% ja ruokavalio oli erittäin arvostettu, ilman eroja nais- ja miesosallistujien välillä. Olemme aiemmin suorittaneet täysin kontrolloituja ruokittavia RCT:itä pidemmällä kestolla (esim. 5×4 viikkoa tai 3×6 viikkoa) tunkevammilla menetelmillä (esim. suolibiopsiat) ja vähemmän tyypillisillä kanadalaisille tavoille ruokavaliolla (esim. Välimeren, maitovapaa), silti keskeytysprosentit eivät koskaan ylittäneet 20% [28, 29, 41]. Peseytymisjaksot vähentävät keskeyttämisriskiä. Emme odota noudattamisongelmia. Suunnittelimme rekrytoivamme 20 osallistujaa, odottaen vähintään 16 suorittavan koko protokollan.

Rekrytointimenettelyt: Sisällyttämiskriteerit: ikä: 18-70 vuotta; BMI: 18-40 kg/m²; halukkuus kuluttaa luonnonjogurttia päivittäin 3 viikon ajan; kahvi/tee kuluttajille, halukkuus kuluttaa näitä juomia ilman lisättyä maitoa, kermaa tai sokeria 4 viikon ajan. Poissulkemiskriteerit: laktoosi-intoleranssi; verenluovutus 2 kuukauden sisällä; vakava krooninen sairaus tai meneillään oleva hoito sairauksille kuten infektiot, autoimmuunisairaudet, syöpä, tyypin 2 diabetes, Crohnin tauti, keliakia, maksa- tai munuaissairaudet; historia vakavasta syövästä, sydän- ja verisuonitaudeista tai bariatrisesta leikkauksesta; epävakaa paino 3 kuukautta; huumausaineiden käyttö tai alkoholismi; tupakointi/kannabiksen poltto/höyrytys (varmistaa, ettei päivittäisi vaihteluita ja objektiivinen kulutuksen raportointi on liian monimutkaista); allergiat tai vastenmielisyydet ruokavalioiden osiin. Osallistujat rekrytoidaan Quebecin kaupungin alueelta INAF:n massasähköposteilla (kattavuus: >5,000) ja Université Lavalin (>20,000). Kiinnostuneita henkilöitä kutsutaan ottamaan yhteyttä CRC:hen seulontapuheluun. Kelpoiset henkilöt kutsutaan sitten henkilökohtaiseen tietotilaisuuteen, jossa selitetään protokollan täydet yksityiskohdat. Kiinnostuneita pyydetään antamaan tietoon perustuva suostumus. Sen jälkeen osallistujat satunnaistetaan ja perusvierailu ajoitetaan. Yhteensä 10 erilaista satunnaistusjärjestystä luodaan käyttäen Williamsin suunnittelua varmistaen, että jokainen hoito seuraa jokaista toista hoitoa yhtä monta kertaa. Jokainen järjestys määrätään yksittäiselle osallistujalle sukupuolikohtaisesti. Odotamme tutkimuksen vaativan 20 viikkoa suorittamiseen. INAF on Kanadan suurimman kliinisen ravitsemustutkimusyksikön (800 m²) koti, ja yksi harvoista maan tiloista, jotka pystyvät täysin kontrolloituihin RCT:ihin. Siinä on metabolinen keittiö, ruokala, tilat biologisten näytteiden keräämiseen, e-alusta ruokavalion arviointiin, osallistujien satunnaistamiseen ja hallintaan sekä metabolomiikka-alusta. Kokopäiväinen tutkimushoitaja on henkilökunnassa. ULAvalin datakeskus varmistaa turvallisen tallennuksen ja analyyttisen kapasiteetin. Tämä huippuluokan infrastruktuuri on avainasemassa projektin onnistumiselle.

Metabolomiikkaprofilointi: Kun tutkimus on valmis, plasmanäytteet käsitellään INAF:n metabolomiikka-alustalla käyttäen neljää täydentävää LC-menetelmää (positiivinen ja negatiivinen elektrosuihkuionisaatio) määrittämään noin 22,000 metaboliitin suhteellinen runsaus. Nämä sisältävät aminohapot, sokerit ja pienet orgaaniset hapot (BEH Amide); polyfenolimetaboliitit ja pienet peptidit (HSS T3); vapaat rasvahapot ja sappihapot (CSH C18); sekä lipidit (BEH C8). Plasmanäytteiden lisäksi käsittelemme myös näytteet kustakin 4 jogurtista ja soijavanukkaasta. Metabolomiikkaprofilointi suoritetaan käyttäen Thermo Vanquish U-HPLC:ta kytkettynä Thermo Fusion Tribrid Orbitrap -massaspektrometriin tai Waters Acquity I-Class UPLC:ta kytkettynä Waters Synapt G2-Si:hin, menetelmästä riippuen. Raakadata käsitellään käyttäen Compound Discovereria ja Progenesis QI:ta. Metaboliittien tunnistaminen suoritetaan käyttäen jatkuvasti kasvavaa INAF:n analyyttisten standardien pankkia (n=1,000 yhdiste, esim. aminohapot, suolistoperäiset metaboliitit, sappihapot, fenoliset yhdisteet, rasvahapot). Lisäksi kiinnostavat kromatografiset piikit saavat todennäköisen tunnistuksen käyttäen useita spektraali- ja molekyylitietokantoja (esim. mzCloud, HMDB). Metabolomiikkaprofilointi odotetaan kestävän 1 kuukauden.

Tilastolliset analyysit: Vaihe 1: mahdollisten jogurttinsaantibiomarkkerien tunnistaminen. Tätä varten pyrimme tunnistamaan kaikki metaboliitit, jotka mahdollistavat erottamisen jogurttia sisältävän ja jogurttittoman ruokavalion välillä. Riippumattomat muuttujat sisältävät kaikkien metaboliittien (n=22,000) suhteellisen runsauden mitattuna kunkin neljän interventio jälkeen, huomioiden plasmanäytteet kustakin osallistujasta nykyisestä tutkimuksesta (320 havaintoa, joista 80 on jogurttittomia) ja aiemmasta maidon ja juuston biomarkkeritutkimuksestamme (n=284 jogurttitonta plasmanäytettä, käsitelty samoilla metabolomiikkamenetelmillä; yhteensä=604). Riippuva muuttuja on "jogurtin läsnäolo ruokavaliossa" (kyllä/ei). Käytämme extreme gradient boosting -algoritmia (XGBoost) luokittelumallien kouluttamiseen [42]. Iteratiivinen prosessi toistetaan n kertaa: (1) mallien kouluttaminen, (2) parhaan ennustuskyvyn omaavan metaboliitin tunnistaminen, laskettuna permutaatiotestauksella, ja (3) tämän metaboliitin poistaminen ennen seuraavaa iteraatiota. Jokaisessa iteraatiossa 25 mallia koulutetaan käyttäen erilaisia osallistujien jakoja koulutus- (80%; n=484 havaintoa) ja testausjoukkoihin (20%; n=120). Iteroinnit jatkuvat, kunnes mallien herkkyyden tai spesifisyyden 95% luottamusväli saavuttaa 0.5 (luokittelualgoritmin nolla ennustusvoima). Tämän vaiheen lopussa n poistettua metaboliittia muodostavat joukon mahdollisia jogurttinsaantibiomarkkereita, jotka säilytetään seuraavia vaiheita varten. Seuraavat vaiheet hyödyntävät standardoituja tilastollisia lähestymistapoja testaamaan validoitun ruokansantibiomarkkerin keskeisiä ominaisuuksia, kuten FoodBALL on ehdottanut. Ellei toisin mainita, kaikki seuraavat testit suoritetaan käyttäen sekamalleja toistetuille mittauksille, metaboliitin suhteellinen runsaus riippuvana muuttujana. Mallit säädetään iän, sukupuolen, painoindeksin ja ruokavalion päivittäisten kalorien kokonaismäärän mukaan.

Vaihe 2, karkea annosvasteisuus: Vertaamme kunkin mahdollisen biomarkkerin suhteellista runsautta jogurttittoman ja jogurttia sisältävien ruokavalioiden jälkeen. Vain ne metaboliitit, joiden runsaus kasvaa jogurtin kulutuksen myötä, etenevät seuraavaan vaiheeseen.

Vaihe 3, hienostunut annosvasteisuus: Vertaamme metaboliittien suhteellista runsautta tutkimuksessa testattujen kolmen jogurttinsaantitason yli. Metaboliitit, jotka osoittavat merkitsevän lineaarisen trendin, kun jogurttiton ruokavalio koodataan 0:ksi, säilytetään.

Vaihe 4, aikavasteisuus: Käyttäen akuutin testiaterian aikana kerättyjä plasmanäytteitä arvioimme, kasvaako metaboliittien suhteellinen runsaus ajan myötä. Metaboliitit, joilla on suurempi käyrän alapuoli (AUC) jogurtinsaannin jälkeen verrattuna soijavanukkaaseen, säilytetään.

Vaihe 5, spesifisyys: Vahvistaakseen spesifisyyden jogurtille, metaboliittien tulee osoittaa kasvanutta runsautta jogurtin kanssa mutta ei maidon tai juuston kanssa. Testataksemme tätä käytämme metabolomiikkadataa, joka on tuotettu prof. Drouin-Chartierin aiemmasta DFC-avustuksesta. Tässä aiemmassa projektissa plasmanäytteitä, jotka kerättiin 4 aiemmin suoritetusta ristiinasetellusta RCT:stä täysin ruokittavilla asetelmilla, joiden tavoitteena oli arvioida maidon tai juuston saannin vaikutusta 4-6 viikon ajan kardiometabolisiin riskitekijöihin, käytettiin metaboliittibiomarkkerien tunnistamiseen maidon ja juuston saannille erikseen. Tämä aineisto sisältää metabolomiikkadataa täysin kontrolloiduista maito- tai juustosisältävistä ruokavalioista ja maitovapaasta ruokavaliosta 118 henkilöltä. Metaboliitit, joiden runsautta maito tai juusto ei lisää, säilytetään tämän vaiheen lopussa. Tämä suoritetaan ilman lisäkustannuksia.

Vaihe 6, robustisuus: Käytämme myös metabolomiikkadataa, joka on tuotettu aiemmassa DFC-avustuksessamme. Nämä tulevat poikkileikkaustutkimuskohortista 200 aikuisesta, jotka antoivat paastoplasmanäytteen ja täyttivät kolme 24 tunnin ruokavaliomuistutusta (R24W) viikolla ennen plasmanäytteenottoa, mukaan lukien yhden raportoimansa ruokansaannit edellisenä päivänä plasmanäytteenoton edellä. Osallistujat jaetaan mediaanin jogurttinsaannin mukaan. Vain ne metaboliitit, joilla on suurempi runsaus osallistujilla mediaanin yläpuolella, säilytetään. Tämä vaihe ei myöskään aiheuta lisäkustannuksia.

Vaihe 7, uskottavuus: Arvioimme säilytettyjen metaboliittien uskottavuutta peräisin oleviksi jogurtista perustuen niiden luonteeseen ja kemiallisiin rakenteisiin käyttäen Maitokoostumustietokantaa. Lisäksi vertaamme näitä metaboliitteja neljän testatun jogurtin metabolomiikkaprofiileihin. Tämän vaiheen jälkeen säilytetyt metaboliitit ovat jo täyttäneet FoodBALL:n keskeiset kriteerit voidakseen pitää validoituina jogurttinsaantibiomarkkereina. Ottaen huomioon jogurtin ainutlaatuiset matriisiominaisuudet, olemme luottavaisia tunnistavamme vähintään yhden metaboliitin, joka täyttää kaikki kriteerit. Aiemmassa työssämme tunnistimme onnistuneesti yhden biomarkkerin maidonsaannille (delta-valerobetaiini, maidolle spesifinen komponentti) ja yhdeksän erilaista muuta juustonsaannille.

Suorituskyvyn arviointi: Ensin koulutamme mallin arvioimaan jogurttinsaantia käyttäen tunnistettuja biomarkkereita ristiinvertaamalla niiden suhteellista runsautta osallistujille tutkimuksen aikana tarjottuihin tunnettuihin jogurttinsaantitasoihin. Tämä tehdään käyttäen Multimarker-algoritmia [43], joka kehitettiin erityisesti mallintamaan ruokansantia biomarkkereiden perusteella [44]. Malli tuottaa kalibrointiyhtälön, jota käytämme kalibroimaan 24 tunnin ruokavaliomuistutustietoja ja tuottamaan biomarkkerikalibroidut arviot jogurttinsaannista. Seuraavaksi arvioimme jogurttinsaantiarvioiden tarkkuutta saatu käyttäen: a) kalibrointiyhtälöä (pelkät biomarkkerit), b) kalibroitua 24 tunnin ruokavaliomuistutusta (biomarkkerit × itse raportoitu saanti), ja c) kalibroimatonta 24 tunnin ruokavaliomuistutusta (pelkkä itse raportoitu saanti), vertaamalla kutakin tutkimuksen ruokalistoissa tarjottuun todelliseen saantiin. Vertaamme Pearsonin korrelaatiokertoimia ja niiden 95% luottamusvälejä menetelmien välillä käyttäen t-testejä.