A joghurtfogyasztás objektív metabolomikai alapú biomarkereinek azonosítása (YOGBIO)

Az Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA) nemrégiben elegendően szilárdnak ítélte a tudományos bizonyítékokat ahhoz, hogy jóváhagyjon egy kérelmet a joghurt és a 2-es típusú diabetes (T2D) kockázatának csökkentése közötti minősített egészségügyi állításról. Ezzel szemben az Egészség Kanada még nem hagyott jóvá hasonló állítást. A meglévő bizonyítékok kizárólag prospektív kohorszvizsgálatokból származnak, amelyek önkitöltős táplálkozási kérdőívekre támaszkodnak, amelyek – bár validáltak – véletlenszerű és szisztematikus hibáknak vannak kitéve, amelyek veszélyeztethetik a bizonyítékok minőségét és akadályozhatják a szabályozási jóváhagyást.

A táplálékbeviteli biomarkerek egyre inkább elismert eszközökként válnak a táplálkozási epidemiológia objektivitásának fokozására. A metabolomika, a plazma metabolitok átfogó profilozása, az arany standardnak tekinthető az ilyen biomarkerek azonosításában. A tejtermékek kontextusában jelentős mérföldkő volt a joghurtfogyasztás metabolomikai aláírásának azonosítása egy nagy spanyol kohorszban. Ez az aláírás – amely 27 metabolitból áll (pl. C14:0 szfingomielin, a mirisztinsavból származtatva) – előre jelezte a joghurtfogyasztást egy független amerikai kohorszban, és alacsonyabb T2D incidenciával állt összefüggésben mindkét populációban. Azonban mivel ez az aláírás megfigyelési adatokból származott, nem volt specifikus a joghurtfogyasztásra.

Ez a projekt ezt a kritikus hiányt kívánja pótolni a joghurtfogyasztás specifikus biomarkereinek felfedezésével és azok elismert kritériumokkal szembeni validálásával.

Véletlenszerű, keresztbeállítású, dózis-válasz táplálkozási vizsgálatot fogunk végezni 16 általában egészséges felnőtt (8 nő, 8 férfi) részvételével. A vizsgálat 4 előre meghatározott diétából fog állni, amelyek mindegyike 7 napig tart, és 1 hetes kimosási periódus választja el őket. Minden diéta 7. napján a résztvevők vegyes étkezéses tesztet fognak végezni az INAF-nál, hogy posztprandiális állapotban plazmamintákat gyűjtsenek. A 4 diéta tejmentes háttérdiétán fog alapulni, amely magas megfelelést tükröz Kanada élelmiszer-útmutatójának, a következő kiegészítésekkel:

1. 125 g per 2.380 kcal naponta szójaalapú puding (azaz joghurtmentes diéta);
2. 90 g per 2.380 kcal naponta joghurt (azaz 0,5 referenciaadag joghurt per 2.380 kcal naponta);
3. 175 g per 2.380 kcal naponta joghurt (azaz 1 referenciaadag joghurt per 2.380 kcal naponta);
4. 350 g per 2.380 kcal naponta joghurt (azaz 2 referenciaadag per 2.380 kcal naponta).

Annak érdekében, hogy az azonosított biomarkerek tükrözzék a joghurtok sokféleségét, négy joghurtfajtát tesztelünk:

a) zsírmentes sima normál joghurt; b) 2%-os tejzsírtartalmú sima normál joghurt; c) zsírmentes sima görög joghurt; d) 2%-os tejzsírtartalmú sima görög joghurt. Minden joghurttípust négy résztvevőhöz rendelünk, akik a vizsgálat során következetesen ugyanazt a típust fogyasztják. A cél nem az, hogy minden joghurttípushoz külön biomarkert azonosítsunk, hanem hogy biztosítsuk, hogy az azonosított biomarker(ek) figyelembe vegyék a joghurttípusok sokféleségét. A joghurtmentes beavatkozáshoz minden résztvevő ugyanazt a szójaalapú pudingot fogyasztja. A résztvevők a négy 7 napos beavatkozást véletlenszerű sorrendben teljesítik. Ez a kialakítás biztosítja, hogy a plazma metabolómban megfigyelt változások kizárólag a joghurtnak tulajdoníthatók.

Mind a négy beavatkozás során az összes ételt és élelmiszert 7 napos ciklikus menü alapján biztosítjuk, ahogyan azt csapatunk korábban is tette [28-30]. Minden beavatkozás háttérdiétája azonos, tejmentes (azaz minden tejterméket és vajat kizárva), és úgy tervezték, hogy magas megfelelést tükrözzön Kanada élelmiszer-útmutatójának, a minimálisan feldolgozott növényi alapú élelmiszerek hangsúlyozásával. Az elfogadhatóság és a megfelelés fokozása érdekében a menü naponta legalább egy receptet fog tartalmazni Kanada hivatalos élelmiszer-útmutatójának dokumentációjából [31, 32]. Egy tapasztalt élelmiszertechnikus készíti el a diétákat, minden élelmiszert és összetevőt pontosan mérve 0,1 g pontossággal. A bevételi biomarkerek azonosításának kontextusában a sima joghurtot tartották a legmegfelelőbb választásnak az ízesített joghurt helyett. Azonban a sima joghurt kevésbé ízletes savanyú íze miatt. Ennek kezelésére a háttérdiéta naponta egy adag apró gyümölcsöt fog tartalmazni, amelyet a résztvevőket arra utasítjuk, hogy keverjék a joghurtba (vagy a szójapudingba) vagy együtt fogyasszák. Mivel a gyümölcsadag szabványosított lesz, és mind a négy beavatkozás során naponta konzisztens mennyiségben fogyasztják, nem vezet be zavaró tényezőt a joghurtbiomarkerek azonosítási folyamatába. Úgy véljük, hogy ez a megközelítés kedvező a megfelelés biztosításához a szójaalapú pudingot tartalmazó diéta során is.

A négy joghurttípus és a három bevételi szint között a joghurt átlagosan 120 kcal/napot fog hozzájárulni, ahogyan a kontroll szójaalapú puding is. A legalacsonyabb kalóriahozzájárulás 40 kcal (zsírmentes sima normál joghurt, 90 g/nap), a legmagasabb pedig 240 kcal (2%-os tejzsírtartalmú sima görög joghurt; 350 g/nap). Ezeket a kalóriákat egy 2.380 kcal/nap háttérdiétához adjuk hozzá, hogy egy szabványos menüt hozzunk létre, amely átlagosan 2.500 kcal/nap lesz a négy beavatkozás során. Tekintve, hogy a beavatkozások mindössze hét napig tartanak, valószínűtlen, hogy a joghurtok vagy a szójaalapú puding kalóriahozzájárulásának különbsége befolyásolná a testsúlyt vagy zavaró tényezőt jelentene. A javasolt megközelítés – a tesztelt élelmiszerek hozzáadása egy azonos izoenergetikus háttérdiétához – az optimális stratégia. Egyetlen résztvevő esetében az egyetlen különbség a négy diéta között a joghurt tartalom lesz, biztosítva, hogy a diéta utáni különbségek a plazma metabolómban kizárólag a joghurtnak tulajdoníthatók. Ezzel szemben, ha hasonló teljes kalóriatartalmat szeretnénk fenntartani a háttérdiétában a négy fázis során, módosításokat kellene végrehajtani a háttérdiétán, ami torzítást okozna a plazma metabolómban. Alapvonalon a résztvevők energiaigényét validált prediktív egyenletekkel becsüljük meg [33], és a diéták teljes energiatartalmát ennek megfelelően állítjuk be.

Mind a négy 7 napos beavatkozás során a résztvevőknek legalább három teljes étkezést kell fogyasztaniuk az INAF-nál a klinikai kutatási koordinátor (CRC) felügyelete alatt. Ezeken a látogatásokon a következő 24-72 órára szóló ételeiket is megkapják. A résztvevőket arra utasítjuk, hogy csak a biztosított élelmiszereket fogyasszák, és minden ételt a szolgáltatott formában egyék meg. Az alkohol, a vitaminkiegészítők és a természetes egészségügyi termékek nem engedélyezettek. A tea és a kávé (≤2 csésze/nap) megengedett lesz, naponta ingadozás nélkül, tej, tejszín vagy cukor hozzáadása nélkül. Korlátlan mennyiségű víz engedélyezett. A résztvevőket arra utasítjuk, hogy a szokásos fizikai aktivitási szintjüket stabilan tartsák a teljes protokoll során. Minden diéta 7. napján a résztvevők akut vegyes étkezéses tesztet fognak végezni, hogy tájékoztassanak a joghurtbiomarkerek időbeli reagálóképességéről. 12 órás böjt után a résztvevők reggel 7:30-kor érkeznek az INAF-hoz. A tesztétel egy reggeli turmixból fog állni, amely tartalmazza ugyanazt a joghurtot (vagy szójaalapú pudingot), amelyet naponta biztosítottak az előző napok során. Plazmamintákat gyűjtenek alapvonalon (böjtölés után) és 1, 2, 4 és 6 órával az étkezés után. A mintákat EDTA csövekbe veszik fel és -80°C-on tárolják.

A teszt során a résztvevőket arra utasítjuk, hogy töltsenek ki egy validált önkitöltős webalapú 24 órás táplálkozási visszahívás (R24W) kérdőívet, amelyet kifejezetten kutatásra validáltak a québeci felnőttek körében [34-40]. Az R24W teljes módszertana és validációja publikálva van [34-40]. Röviden, az R24W arra vezeti a résztvevőket, hogy feltüntessék az előző nap fogyasztott összes élelmiszert és italt, beleértve az alkoholt. Az R24W lehetővé teszi a fogyasztott élelmiszerek és italok kiválasztását egy strukturált élelmiszerlistán való böngészéssel vagy egy keresőmotor használatával. Szabványosított képeket is tartalmaz a porcióméret felmérésének segítésére. Ezeket az adatokat arra használjuk, hogy összehasonlítsuk az R24W teljesítményét a joghurtbiomarkerekével a diéta valódi joghurttartalmának becslésében.

A résztvevők és a CRC nem lehetnek vakok a diéta kiosztására. Azonban a diétákban lévő joghurt (vagy szójaalapú puding) pontos mennyiségét nem hozzák nyilvánosságra a résztvevők előtt. A négy diétát véletlenszerűen betűkkel jelölik (pl. A=magas joghurt, B=szója, C=alacsony joghurt, D=mérsékelt joghurt). Ez a megközelítés minimalizálja az információ torzítását az R24W kitöltéséhez minden beavatkozás végén. Minden beavatkozást 1 hetes kimosási periódus választ el, hogy a résztvevőknek szünetet biztosítsanak, csökkentve a többhetes beavatkozással járó kiesések kockázatát. A kimosási időszakban a résztvevőket arra utasítjuk, hogy térjenek vissza szokásos diétájukhoz. Nem várjuk, hogy a kimosási időszak alatti diéta hordozási hatással legyen a következő 7 napos beavatkozási időszakokra a joghurtbevételi biomarkerek azonosítását illetően. Valóban, a joghurtbevételi biomarkerek azonosítása kihasználja a minden beavatkozás 7. napján gyűjtött plazmamintákat, mind böjtölési, mind posztprandiális állapotban. Így nagyon valószínűtlen, hogy a kimosási időszak alatt fogyasztott élelmiszerből származó biomarker mutassa a javasolt kialakítás szerint várható akut posztprandiális reagálóképességet a joghurtbevételi biomarkerekre [27]. A teljes vizsgálati részvétel 7 hét lesz. A vizsgálat végén minden résztvevő esetében összesen 15 plazmamintánk lesz, amelyeket joghurtfogyasztás után gyűjtöttünk (azaz 5 minta × 3 joghurtbevételi szint), és 5 mintánk, amelyeket a joghurtmentes diéta után gyűjtöttünk, összesen 240 poszt-joghurt minta és 80 joghurt nélküli minta (összesen=320).

Megfelelés és várt kiesések: Ellenőrzőlistát biztosítunk a napi élelmiszerfogyasztás nyomon követésére. Három teljes étkezés fogyasztása az INAF-nál a CRC felügyelete alatt erősíti a protokollhoz való ragaszkodást. Korábbi, hasonló kialakítású tanulmányainkban a biztosított élelmiszerek 99%-át fogyasztották el [28, 29], csak anekdotális eltérésekkel, amelyeket mind önmaguk jelentettek. Prof. Drouin-Chartier eredetileg kifejlesztette és használta ugyanezt a 7 napos menüt egy CIHR által finanszírozott, teljesen táplált RCT-ben 50 heterozigóta familiares hypercholesterolaemiás felnőttnél, 4 hetes beavatkozásokkal. A megfelelés >99% volt, és a diéta nagyra értékelt volt, nincs különbség a női és férfi résztvevők között. Korábban már végeztünk teljesen kontrollált táplálkozási RCT-ket hosszabb időtartamban (pl. 5×4 hét vagy 3×6 hét) invazívabb eljárásokkal (pl. bélbiopszia) és kevésbé tipikus kanadai szokásokat tükröző diétákkal (pl. mediterrán, tejmentes), mégis a kiesési arány soha nem haladta meg a 20%-ot [28, 29, 41]. A kimosási időszakok csökkentik a kiesés kockázatát. Nem várunk megfelelési problémát. 20 résztvevő bevonását terveztük, várhatóan legalább 16 teljesíti a teljes protokollt.

Rekrutálási eljárások: Beválasztási kritériumok: életkor: 18-70 év; BMI: 18-40 kg/m²; hajlandóság a sima joghurt napi fogyasztására 3 hétig; a kávé/tea fogyasztók számára hajlandóság ezeknek az italoknak tej, tejszín vagy cukor hozzáadása nélküli fogyasztására 4 hétig. Kizárási kritériumok: laktóz intolerancia; vérátömlesztés 2 hónapon belül; súlyos krónikus betegség vagy folyamatban lévő kezelés olyan állapotok miatt, mint fertőzések, autoimmun betegségek, rák, 2-es típusú diabetes, Crohn-betegség, cöliákia, máj- vagy vese betegségek; súlyos rák, cardiovascularis betegség vagy bariatrikus sebészet előzménye; instabil testsúly 3 hónapig; tiltott szerhasználat vagy alkoholizmus; dohány/cannabis dohányzás/vaporizálás (biztosítva, hogy ne legyen napi ingadozás, és az objektív fogyasztásjelentés túl bonyolult lenne); allergia vagy ellenszenv a diéták összetevőivel szemben. A résztvevőket a Québec City környékéről fogják toborozni az INAF tömeges e-mailjein keresztül (elérés: >5.000) és a Université Laval (>20.000). Az érdeklődőket felkérik, hogy lépjenek kapcsolatba a CRC-vel egy szűrőtelefonhíváshoz. A jogosult személyeket ezután személyes tájékoztató ülésre hívják meg, ahol a protokoll teljes részleteit elmagyarázzák. Az érdeklődőket felkérik, hogy adjanak tájékoztatott beleegyezést. Ezután a résztvevőket randomizálják, és egy alapvonal látogatást ütemeznek. Összesen 10 különböző randomizációs sorozatot generálnak William's kialakítással, hogy biztosítsák, hogy minden kezelés minden másik kezelést ugyanannyiszor követ. Minden sorozatot egyetlen résztvevőhöz rendelnek, nem specifikus módon. Várjuk, hogy a vizsgálat befejezéséhez 20 hétre lesz szükség. Az INAF otthont ad Kanada legnagyobb klinikai táplálkozáskutatási egységének (800 m²), és az ország egyik kevés létesítménye, amely képes teljesen kontrollált RCT-kre. Metabolikus konyhát, étkezőt, biológiai mintagyűjtési terek, e-platformot a táplálkozásértékeléshez, résztvevő randomizáláshoz és menedzseléshez, valamint metabolomikai platformot tartalmaz. Teljes munkaidős kutatóápoló dolgozik. Az ULaval adatközpontja biztosítja a biztonságos tárolást és analitikai kapacitást. Ez a legmodernebb infrastruktúra kulcsfontosságú a projekt sikeréhez.

Metabolomikai profilozás: A vizsgálat befejezése után a plazmamintákat az INAF metabolomikai platformján dolgozzák fel négy kiegészítő LC módszerrel (pozitív és negatív elektrospray ionizáció) ~22.000 metabolit relatív abundanciájának meghatározására. Ezek közé tartoznak az aminosavak, cukrok és kis szerves savak (BEH Amide); polifenol metabolitok és kis peptidje (HSS T3); szabad zsírsavak és epe savak (CSH C18); és lipidek (BEH C8). A plazmaminták mellett a 4 joghurt és a szójapuding mintáit is feldolgozzuk. A metabolomikai profilozást Thermo Vanquish U-HPLC-pel, Thermo Fusion Tribrid Orbitrap tömegspektrométerhez kapcsolva, vagy Waters Acquity I-Class UPLC-vel, Waters Synapt G2-Si-hez kapcsolva végzik, a módszertől függően. A nyers adatokat Compound Discoverer és Progenesis QI segítségével dolgozzák fel. A metabolit azonosítást az egyre növekvő INAF analitikai szabványbank (n=1.000 vegyület, pl. aminosavak, bél eredetű metabolitok, epe savak, fenolos vegyületek, zsírsavak) segítségével végzik. További érdekes kromatográfiai csúcsokat több spektrális és molekuláris adatbázis (pl. mzCloud, HMDB) segítségével azonosítanak feltételezés szerint. A metabolomikai profilozás várhatóan 1 hónapig tart.

Statisztikai elemzések: 1. lépés: a joghurtbevétel potenciális biomarkereinek azonosítása. Ehhez minden olyan metabolit azonosítását célozzuk, amely lehetővé teszi a joghurtot tartalmazó és a joghurtmentes diéta megkülönböztetését. A független változók közé tartozik az összes metabolit (n=22.000) relatív abundanciája, amelyet a négy beavatkozás mindegyike után mértek, figyelembe véve a jelen vizsgálat minden résztvevőjének plazmamintáit (320 megfigyelés, ebből 80 joghurtmentes), és a korábbi tej- és sajtbiomarker tanulmányunkból (n=284 joghurtmentes plazmaminta, ugyanazokkal a metabolomikai módszerekkel feldolgozva; összesen=604). A függő változó a „joghurt jelenléte a diétában” (igen/nem) lesz. Az extrém gradiens erősítő algoritmust (XGBoost) fogjuk használni a klasszifikációs modellek betanításához [42]. Egy iteratív folyamatot ismétlünk n alkalommal: (1) a modellek betanítása, (2) a legjobb prediktív képességű metabolit azonosítása, amelyet permutációs teszteléssel számítunk ki, és (3) ennek a metabolitnak az eltávolítása a következő iteráció előtt. Minden iterációhoz 25 modellt fogunk betanítani a résztvevők különböző felosztásával tanuló (80%; n=484 megfigyelés) és tesztelő (20%; n=120) halmazokra. Az iterációk addig folytatódnak, amíg a modellek érzékenységének vagy specifikusságának 95%-os konfidenciaintervalluma el nem éri a 0,5-öt (egy klasszifikációs algoritmus null prediktív ereje). Ennek a lépésnek a végén az n eltávolított metabolit alkotja a joghurtbevétel potenciális biomarkereinek készletét, amelyet a következő lépésekhez megtartanak. A következő lépések standard statisztikai megközelítéseket használnak fel egy validált táplálékbevételi biomarkerek kulcsfontosságú jellemzőinek tesztelésére, ahogy azt a FoodBALL javasolja. Hacsak másképp nincs megadva, az összes következő tesztet ismételt mérések vegyes modelleivel fogjuk elvégezni, a metabolit relatív abundanciát függő változóként használva. A modelleket életkor, nem, testtömegindex és a diéta napi teljes kalóriája szerint fogjuk igazítani.

2. lépés, nyers dózis-reagálóképesség: Összehasonlítjuk az egyes potenciális biomarkerek relatív abundanciáját a joghurtmentes és a joghurtot tartalmazó diéták után. Csak azok a metabolitok haladnak tovább a következő lépésre, amelyek abundanciája a joghurtfogyasztással nő.

3. lépés, finomított dózis-reagálóképesség: Összehasonlítjuk a metabolitok relatív abundanciáját a vizsgálatban tesztelt három joghurtbevételi szint között. A jelentős lineáris trendet mutató, a joghurtmentes diétát 0-kódolással kezelt metabolitokat megtartjuk.

4. lépés, időbeli reagálóképesség: Az akut tesztétel során gyűjtött plazmaminták adatait felhasználva értékeljük, hogy a metabolitok relatív abundanciája növekszik-e idővel. A terület alatti görbe (AUC) nagyobb a joghurtbevitel után a szójaalapú pudinghoz képest mutató metabolitokat megtartjuk.

5. lépés, specifikusság: A joghurtra való specifikusság megerősítéséhez a metabolitoknak növekedett abundanciát kell mutatniuk a joghurt mellett, de nem a tej vagy sajt mellett. Ennek teszteléséhez a Prof. Drouin-Chartier korábbi DFC pályázatából generált metabolomikai adatokat fogjuk használni. Ebben a korábbi projektben a 4 korábban végzett keresztbeállítású RCT-ből gyűjtött plazmamintákat használták, amelyek teljes táplálkozási körülményekkel rendelkeztek, és a tej vagy sajtbevitel 4-6 hétig tartó hatását értékelték cardiometabolikus kockázati tényezőkre, hogy külön-külön azonosítsák a tej- és sajtbevételi metabolit biomarkereket. Ez az adathalmaz tartalmaz metabolomikai adatokat teljesen kontrollált tej- vagy sajtot tartalmazó diétákból és tejmentes diétából 118 egyén esetében. Azok a metabolitok maradnak meg ennek a lépésnek a végén, amelyek abundanciája nem nő a tej vagy sajt hatására. Ezt további költség nélkül fogjuk elvégezni.

6. lépés, robusztusság: A múltbeli DFC pályázatunkból generált metabolomikai adatokat is felhasználjuk. Ezek egy 200 felnőtt keresztmetszeti kohorszától származnak, akik böjtölési plazmamintát adtak, és kitöltöttek három 24 órás táplálkozási visszahívást (R24W) a plazmamintavétel előtti héten, beleértve egyet, amely a plazmamintavétel előtti nap táplálkozási bevitelükről számolt be. A résztvevőket a medián joghurtbevitel szerint osztják fel. Csak azok a metabolitok maradnak meg, amelyek nagyobb abundanciával rendelkeznek a medián feletti résztvevőknél. Ez a lépés szintén nem jelent további költséget.

7. lépés, plauszibilitás: Értékeljük a megtartott metabolitok plauszibilitását, hogy joghurtból származnak-e, természetük és kémiai szerkezetük alapján, a Tej Összetételi Adatbázis felhasználásával. Ezen kívül összehasonlítjuk ezeket a metabolitokat a négy tesztelt joghurt metabolomikai profiljaival. Ennek a lépésnek a végén a megtartott metabolitok már kielégítik a FoodBALL alapvető kritériumait ahhoz, hogy validált joghurtbevételi biomarkereknek tekintsék őket. Tekintve a joghurt egyedi mátrix jellemzőit, biztosak vagyunk abban, hogy legalább egy metabolitot azonosítunk, amely minden kritériumnak megfelel. Korábbi munkánkban sikeresen azonosítottunk egy biomarkert a tejbevitelhez (delta-valerobetain, egy tej-specifikus komponens) és kilenc másikat a sajtbevitelhez.

Teljesítményértékelés: Először egy modellt fogunk betanítani a joghurtbevitel becslésére az azonosított biomarkerek felhasználásával, keresztreferálva relatív abundanciájukat a vizsgálat során a résztvevőknek biztosított ismert joghurtbevételi szintekkel. Ezt a Multimarker algoritmus [43] segítségével fogjuk elvégezni, amelyet kifejezetten a táplálékbevitel biomarkerek alapján történő modellezésére fejlesztettek ki [44]. A modell egy kalibrációs egyenletet generál, amelyet a 24 órás táplálkozási visszahívási adatok kalibrálására és a joghurtbevitel biomarker-kalibrált becsléseinek előállítására fogjuk használni. Ezután értékeljük a joghurtbevitel becslések pontosságát, amelyeket a következőkkel kaptunk: a) a kalibrációs egyenlet (csak biomarkerek), b) a kalibrált 24 órás táplálkozási visszahívás (biomarkerek × önjelentett bevitel), és c) a nem kalibrált 24 órás táplálkozási visszahívás (csak önjelentett bevitel), mindegyiket összehasonlítva a vizsgálati menükben biztosított valódi bevétellel. Összehasonlítjuk a Pearson korrelációs együtthatókat és 95%-os konfidenciaintervallumaikat a módszerek között t-próbákkal.