Identifikace objektivních biomarkerů konzumace jogurtu na základě metabolomiky (YOGBIO)

Americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv nedávno uznal vědecké důkazy dostatečně robustními pro schválení žádosti o kvalifikované zdravotní tvrzení týkající se jogurtu a snížení rizika diabetu 2. typu (T2D). Naproti tomu Health Canada dosud podobné tvrzení neschválil. Stávající důkazy pocházejí výhradně z prospektivních kohortových studií založených na dotaznících o stravování, které jsou sice validované, ale podléhají náhodným a systematickým chybám, jež mohou ohrozit kvalitu důkazů a ztížit regulační schválení.

Biomarkery příjmu potravy jsou stále více uznávány jako cenné nástroje pro zvýšení objektivity v nutriční epidemiologii. Metabolomika, komplexní profilace plazmatických metabolitů, je považována za zlatý standard pro identifikaci takových biomarkerů. V kontextu mléčných výrobků byl významným milníkem identifikace metabolomického podpisu příjmu jogurtu ve velké španělské kohortě. Tento podpis zahrnující 27 metabolitů (např. C14:0 sfingomyelin odvozený od kyseliny myristové) byl prediktivní pro příjem jogurtu v nezávislé americké kohortě a asociovaný s nižší incidencí T2D v obou populacích. Protože však tento podpis vznikl z observačních dat, postrádal specifičnost pro příjem jogurtu.

Tento projekt si klade za cíl vyplnit tuto kritickou mezeru objevením specifických biomarkerů příjmu jogurtu a jejich validací podle uznávaných kritérií.

Provedeme randomizovanou, křížovou, dávkově-odpovídající krmnou studii zahrnující 16 obecně zdravých dospělých (8 žen, 8 mužů). Studie bude sestávat ze 4 předem stanovených diet, každá trvající 7 dní a oddělených 1týdenním vyplachovacím obdobím. 7. den každé diety podstoupí účastníci smíšený jídelní test v INAF za účelem odběru plazmatických vzorků v postprandiálním stavu. 4 diety budou založeny na bezmléčné základní dietě reflektující vysokou adherenci k kanadskému potravinovému průvodci, s následujícími přídavky:

1. 125 g na 2 380 kcal denně sojového pudinku (tj. dieta bez jogurtu);
2. 90 g na 2 380 kcal denně jogurtu (tj. 0,5 referenční porce jogurtu na 2 380 kcal denně);
3. 175 g na 2 380 kcal denně jogurtu (tj. 1 referenční porce jogurtu na 2 380 kcal denně);
4. 350 g na 2 380 kcal denně jogurtu (tj. 2 referenční porce na 2 380 kcal denně).

Pro zajištění, že identifikované biomarkery reflektují rozmanitost jogurtů, budou testovány čtyři odrůdy jogurtu:

a) odtučněný bílý běžný jogurt; b) bílý běžný jogurt s 2 % mléčného tuku; c) odtučněný bílý řecký jogurt; d) bílý řecký jogurt s 2 % mléčného tuku. Každý typ jogurtu bude přidělen čtyřem účastníkům, kteří jej budou konzumovat konzistentně po celou dobu studie. Cílem není identifikovat odlišný biomarker pro každý typ jogurtu, ale zajistit, že identifikovaný/é biomarkery zohlední rozmanitost typů jogurtů. Pro intervenci bez jogurtu budou všichni účastníci konzumovat stejný sojový pudink. Účastníci dokončí čtyři 7denní intervence v náhodném pořadí. Tento design zajišťuje, že jakékoli pozorované variace v plazmatickém metabolomu budou přisuzovány výhradně jogurtu.

Během všech čtyř intervencí budou všechna jídla a potraviny poskytovány pomocí 7denního cyklického menu, jak již náš tým dříve provedl [28-30]. Základní dieta pro každou intervenci bude identická, bezmléčná (tj. vylučující veškeré mléčné výrobky a máslo) a navržená tak, aby odrážela vysokou adherenci k kanadskému potravinovému průvodci, s důrazem na minimálně zpracované rostlinné potraviny. Pro zvýšení přijatelnosti a adherence bude menu každý den obsahovat alespoň jeden recept z oficiální dokumentace kanadského potravinového průvodce [31, 32]. Diety připraví zkušený potravinářský technik, přičemž všechny potraviny a ingredience budou přesně zváženy s přesností na 0,1 g. V kontextu identifikace biomarkerů příjmu byl bílý jogurt považován za nejvhodnější volbu namísto ochuceného jogurtu. Bílý jogurt je však méně chutný kvůli své kyselé chuti. K řešení tohoto problému bude základní dieta zahrnovat denní porci drobného ovoce, které budou účastníci instruováni buď vmíchat do jogurtu (nebo sojového pudinku), nebo konzumovat spolu s ním. Protože porce ovoce bude standardizovaná a konzumovaná ve stejných množstvích každý den napříč čtyřmi intervencemi, nezavede záměnu v procesu identifikace biomarkerů jogurtu. Tento přístup považujeme také za příznivý pro zajištění compliance během diety obsahující sojový pudink.

Napříč čtyřmi typy jogurtů a třemi úrovněmi příjmu bude jogurt přispívat průměrně 120 kcal/den, stejně jako kontrolní sojový pudink. Nejnižší kalorický příspěvek bude 40 kcal (odtučněný bílý běžný jogurt, 90 g/den) a nejvyšší 240 kcal (bílý řecký jogurt s 2 % mléčného tuku; 350 g/den). Tyto kalorie budou přidány k základní dietě 2 380 kcal/den za účelem vytvoření standardizovaného menu, které bude průměrně činit 2 500 kcal/den napříč čtyřmi intervencemi. Vzhledem k tomu, že intervence trvají pouze sedm dní, je nepravděpodobné, že rozdíl v kalorickém příspěvku jogurtů nebo sojového pudinku ovlivní tělesnou hmotnost nebo zavede záměnu. Navrhovaný přístup – přidání testovaných potravin k identické isoenergetické základní dietě – je optimální strategií. Pro jednoho účastníka bude jediným rozdílem mezi čtyřmi dietami obsah jogurtu, což zajišťuje, že jakékoli rozdíly v plazmatickém metabolomu po dietě budou přisuzovány výhradně jogurtu. Naopak, pokud bychom se rozhodli zachovat podobný celkový kalorický obsah základní diety napříč čtyřmi fázemi, byly by nutné změny základní diety, což by zavedlo zkreslení v plazmatickém metabolomu. Na začátku budou energetické potřeby účastníků odhadnuty pomocí validovaných prediktivních rovnic [33] a celkový energetický obsah diet bude odpovídajícím způsobem upraven, aby tyto potřeby splnil.

Během každé ze čtyř 7denních intervencí budou účastníci povinni konzumovat alespoň tři plná jídla v INAF pod dohledem klinického výzkumného koordinátora (CRC). Během těchto návštěv také obdrží jídla na následujících 24 až 72 hodin. Účastníci budou instruováni, aby konzumovali pouze poskytnuté potraviny a snědli všechna jídla tak, jak jsou dodána. Alkohol, vitaminové doplňky a přírodní zdravotní produkty nebudou povoleny. Čaj a káva (≤2 šálky/den) budou povoleny, bez denních výkyvů a bez mléka, smetany nebo cukru. Nevymezené množství vody bude povoleno. Účastníci budou instruováni, aby udržovali svou obvyklou úroveň fyzické aktivity stabilní po celou dobu protokolu. 7. den každé diety podstoupí účastníci akutní smíšený jídelní test, který poskytne informace o časové odezvě biomarkerů jogurtu. Po 12hodinovém půstu dorazí účastníci do INAF v 7:30 ráno. Testovací jídlo bude sestávat ze snídaňového smoothie obsahujícího stejný jogurt (nebo sojový pudink), který byl poskytován denně během předchozích dnů. Plazmatické vzorky budou odebrány na začátku (nalačno) a 1, 2, 4 a 6 hodin po jídle. Vzorky budou odebrány do zkumavek s EDTA a skladovány při -80 °C.

Během testu budou účastníci instruováni k vyplnění validovaného samo-administrovaného webového 24hodinového dietního dotazníku (R24W), specificky validovaného pro výzkum mezi dospělými v Quebecu [34-40]. Úplná metodologie a validace R24W je publikována [34-40]. Stručně, R24W vede účastníky k uvedení všech potravin a nápojů, včetně alkoholu, konzumovaných během předchozího dne. R24W umožňuje vybírat konzumované potraviny a nápoje procházením strukturovaného seznamu potravin nebo použitím vyhledávače. Obsahuje také standardizované obrázky pro pomoc při hodnocení velikosti porcí. Tato data budou použita k porovnání výkonu R24W s výkonem biomarkerů jogurtu při odhadu skutečného obsahu jogurtu v dietě.

Účastníci a CRC nemohou být zaslepeni k alokaci diety. Přesné množství jogurtu (nebo sojového pudinku) v dietách však nebude účastníkům sděleno. Čtyři diety budou náhodně označeny písmeny (např. A=vysoký jogurt, B=soja, C=nízký jogurt, D=střední jogurt). Tento přístup minimalizuje informační zkreslení pro vyplnění R24W na konci každé intervence. Každá intervence bude oddělena 1týdenním vyplachovacím obdobím, aby účastníkům poskytla přestávku, čímž se sníží riziko odpadnutí spojené s vícedenní intervencí. Během vyplachovacího období budou účastníci instruováni, aby se vrátili ke své obvyklé dietě. Neočekáváme žádné přenosové účinky diety během vyplachovacího období na následující 7denní intervenční období s ohledem na identifikaci biomarkerů příjmu jogurtu. Identifikace biomarkerů příjmu jogurtu skutečně využije plazmatické vzorky odebrané sedmý den každé intervence, jak v půstu, tak v postprandiálním stavu. Je tedy velmi nepravděpodobné, že biomarker z potravy konzumované během vyplachovacího období vykazuje akutní postprandiální odezvu očekávanou pro biomarker příjmu jogurtu v navrženém designu [27]. Celková účast ve studii bude 7 týdnů. Na konci studie budeme mít pro každého účastníka celkem 15 plazmatických vzorků odebraných po konzumaci jogurtu (tj. 5 vzorků × 3 úrovně příjmu jogurtu) a 5 vzorků odebraných po dietě bez jogurtu, celkem 240 vzorků po jogurtu a 80 bez jogurtu (celkem=320).

Compliance a očekávané odpadnutí: Bude poskytnut kontrolní seznam pro sledování denní konzumace potravin. Konzumace 3 plných jídel v INAF pod dohledem CRC posílí adherenci k protokolu. V našich předchozích studiích s podobným designem bylo zkonzumováno 99 % poskytnutých potravin [28, 29], s pouze ojedinělými odchylkami, všechny sebehlášené. Prof. Drouin-Chartier původně vyvinul a použil stejné 7denní menu v rámci plně krmené RCT financované CIHR u 50 dospělých s heterozygotní familiární hypercholesterolemií, s intervencemi trvajícími 4 týdny. Compliance byla >99 % a dieta byla velmi ceněna, bez rozdílů mezi ženskými a mužskými účastníky. Již jsme prováděli plně kontrolované krmené RCT delšího trvání (např. 5×4 týdny nebo 3×6 týdnů) s invazivnějšími procedurami (např. střevní biopsie) a dietami méně typickými pro kanadské zvyky (např. středomořská, bezmléčná), přičemž míra odpadnutí nikdy nepřekročila 20 % [28, 29, 41]. Vyplachovací období snižují riziko odpadnutí. Neočekáváme žádné problémy s compliance. Plánujeme zařadit 20 účastníků s očekáváním, že alespoň 16 dokončí celý protokol.

Postupy náboru: Inkluzní kritéria: věk: 18-70 let; BMI: 18-40 kg/m²; ochota konzumovat bílý jogurt denně po dobu 3 týdnů; pro konzumenty kávy/čaje ochota konzumovat tyto nápoje bez přidaného mléka, smetany nebo cukru po dobu 4 týdnů. Exkluzní kritéria: intolerance laktózy; darování krve do 2 měsíců; závažné chronické onemocnění nebo probíhající léčba stavů jako infekce, autoimunitní onemocnění, rakovina, diabetes 2. typu, Crohnova choroba, celiakie, jaterní nebo renální onemocnění; anamnéza závažné rakoviny, kardiovaskulárního onemocnění nebo bariatrické chirurgie; nestabilní tělesná hmotnost po dobu 3 měsíců; užívání nelegálních drog nebo alkoholismus; kouření/vaping tabáku/konopí (zajištění absence denních výkyvů a objektivní hlášení konzumace je příliš složité); alergie nebo averze ke složkám diet. Účastníci budou nábíráni z oblasti Quebec City prostřednictvím hromadných e-mailů z INAF (dosah: >5 000) a Université Laval (>20 000). Zájemci budou vyzváni, aby kontaktovali CRC pro screeningový telefonický rozhovor. Způsobilí jedinci pak budou pozváni na osobní informační schůzku, kde budou vysvětleny úplné podrobnosti protokolu. Zájemci budou požádáni o poskytnutí informovaného souhlasu. Poté budou účastníci randomizováni a naplánována bude vstupní návštěva. Bude vygenerováno celkem 10 různých randomizačních sekvencí pomocí Williamova designu, aby každá léčba následovala každou jinou léčbu stejným počtem opakování. Každá sekvence bude přidělena jednomu účastníkovi, specificky podle pohlaví. Očekáváme, že studie bude vyžadovat 20 týdnů k dokončení. INAF je domovem největší klinické nutriční výzkumné jednotky v Kanadě (800 m²) a jedním z mála zařízení v zemi schopných plně kontrolovaných RCT. Obsahuje metabolickou kuchyni, kavárnu, prostory pro odběr biologických vzorků, e-platformu pro dietní hodnocení, randomizaci a management účastníků a metabolomickou platformu. Na plný úvazek je zaměstnána výzkumná sestra. Datové centrum ULaval zajišťuje bezpečné uložení a analytickou kapacitu. Tato špičková infrastruktura je klíčová pro úspěch projektu.

Metabolomické profilování: Po dokončení studie budou plazmatické vzorky zpracovány na metabolomické platformě INAF pomocí čtyř komplementárních LC metod (pozitivní a negativní elektrosprejová ionizace) za účelem stanovení relativní abundance ~22 000 metabolitů. Mezi ně patří aminokyseliny, cukry a malé organické kyseliny (BEH Amide); metabolity polyfenolů a malé peptidy (HSS T3); volné mastné kyseliny a žlučové kyseliny (CSH C18); a lipidy (BEH C8). Kromě plazmatických vzorků také zpracujeme vzorky každého ze 4 jogurtů a sojového pudinku. Metabolomické profilování bude provedeno pomocí Thermo Vanquish U-HPLC spojeného s hmotnostním spektrometrem Thermo Fusion Tribrid Orbitrap nebo Waters Acquity I-Class UPLC spojeného s Waters Synapt G2-Si, v závislosti na metodě. Surová data budou zpracována pomocí Compound Discoverer a Progenesis QI. Identifikace metabolitů bude provedena pomocí stále rostoucí banky analytických standardů INAF (n=1 000 sloučenin, např. aminokyseliny, metabolity střevního původu, žlučové kyseliny, fenolické sloučeniny, mastné kyseliny). Další chromatografické píky zájmu podstoupí předběžnou identifikaci pomocí více spektrálních a molekulárních databází (např. mzCloud, HMDB). Očekává se, že metabolomické profilování zabere 1 měsíc.

Statistické analýzy: Krok 1: identifikace potenciálních biomarkerů příjmu jogurtu. K tomu chceme identifikovat všechny metabolity umožňující rozlišit dietu obsahující jogurt od diety bez jogurtu. Nezávislé proměnné budou zahrnovat relativní abundanci všech metabolitů (n=22 000) měřených po každé ze čtyř intervencí, uvažujících plazmatické vzorky pro každého účastníka z této studie (320 pozorování, z nichž 80 je bez jogurtu), a z naší předchozí studie biomarkerů mléka a sýra (n=284 plazmatických vzorků bez jogurtu, zpracovaných pomocí stejných metabolomických metod; celkem=604). Závislá proměnná bude "přítomnost jogurtu v dietě" (ano/ne). Použijeme algoritmus extrémního gradientového posilování (XGBoost) k trénování klasifikačních modelů [42]. Iterativní proces bude opakován n krát: (1) trénování modelů, (2) identifikace metabolitu s nejlepší prediktivní schopností, vypočtené permutačním testováním, a (3) odstranění tohoto metabolitu před další iterací. Pro každou iteraci bude trénováno 25 modelů pomocí různých rozdělení účastníků na trénovací (80 %; n=484 pozorování) a testovací (20 %; n=120) sady. Iterace budou pokračovat, dokud 95% interval spolehlivosti senzitivity nebo specificity modelů nedosáhne 0,5 (nulová prediktivní síla klasifikačního algoritmu). Na konci tohoto kroku bude n odstraněných metabolitů tvořit pool potenciálních biomarkerů příjmu jogurtu, které budou zachovány pro následující kroky. Následující kroky využijí standardní statistické přístupy k testování klíčových charakteristik validovaného biomarkeru příjmu potravy, jak navrhuje FoodBALL. Pokud není uvedeno jinak, všechny následující testy budou provedeny pomocí smíšených modelů pro opakovaná měření, s relativní abundancí metabolitů jako závislou proměnnou. Modely budou upraveny pro věk, pohlaví, index tělesné hmotnosti a celkové denní kalorie z diety.

Krok 2, hrubá dávková odezva: Porovnáme relativní abundanci každého potenciálního biomarkeru po dietách bez jogurtu a s jogurtem. Pouze metabolity, jejichž abundance se zvyšuje s konzumací jogurtu, postoupí do dalšího kroku.

Krok 3, rafinovaná dávková odezva: Porovnáme relativní abundanci metabolitů napříč třemi testovanými úrovněmi příjmu jogurtu ve studii. Metabolity vykazující významný lineární trend, s dietou bez jogurtu kódovanou jako 0, budou zachovány.

Krok 4, časová odezva: Pomocí dat z plazmatických vzorků odebraných během akutního testovacího jídla zhodnotíme, zda se relativní abundance metabolitů zvyšuje v čase. Metabolity s větší plochou pod křivkou (AUC) po příjmu jogurtu ve srovnání se sojovým pudinkem budou zachovány.

Krok 5, specifičnost: Pro potvrzení specifičnosti k jogurtu musí metabolity vykazovat zvýšenou abundanci s jogurtem, ale ne s mlékem nebo sýrem. K testování toho použijeme metabolomická data generovaná z předchozího grantu DFC drženého prof. Drouin-Chartier. V tomto předchozím projektu byly plazmatické vzorky odebrané ze 4 dříve provedených křížových RCT s plně krmeným nastavením, jejichž cílem bylo vyhodnotit dopad příjmu mléka nebo sýra po dobu 4 až 6 týdnů na kardiometabolické rizikové faktory, použity k identifikaci metabolitových biomarkerů příjmu mléka a sýra, odděleně. Tento dataset obsahuje metabolomická data z plně kontrolovaných diet obsahujících mléko nebo sýr a bezmléčné diety pro 118 jedinců. Metabolity, jejichž abundance není zvýšena mlékem nebo sýrem, budou zachovány na konci tohoto kroku. Toto bude provedeno bez dodatečných nákladů.

Krok 6, robustnost: Také použijeme metabolomická data generovaná v našem minulém grantu DFC. Ta budou pocházet z průřezové kohorty 200 dospělých, kteří poskytli vzorek plazmy nalačno a vyplnili tři 24hodinové dietní dotazníky (R24W) v týdnu před odběrem plazmy, včetně jednoho hlášení o jejich dietních příjmech den před odběrem plazmy. Účastníci budou rozděleni podle mediánu příjmu jogurtu. Pouze metabolity s větší abundancí u účastníků nad mediánem budou zachovány. Tento krok také nezpůsobí dodatečné náklady.

Krok 7, plausibilita: Zhodnotíme plausibilitu zachovaných metabolitů jako pocházejících z jogurtu na základě jejich povahy a chemických struktur, pomocí databáze složení mléka. Navíc porovnáme tyto metabolity s metabolomickými profily čtyř testovaných jogurtů. Po tomto kroku již zachované metabolity splní podstatná kritéria FoodBALL pro to, aby byly považovány za validované biomarkery příjmu jogurtu. Vzhledem k unikátním matricovým vlastnostem jogurtu jsme si jisti identifikací alespoň jednoho metabolitu splňujícího všechna kritéria. V naší předchozí práci jsme úspěšně identifikovali jeden biomarker pro příjem mléka (delta-valerobetain, mléku specifická složka) a devět různých dalších pro příjem sýra.

Hodnocení výkonnosti: Nejprve natrénujeme model pro odhad příjmu jogurtu pomocí identifikovaných biomarkerů křížovým odkazováním jejich relativní abundance se známými úrovněmi příjmu jogurtu poskytnutými účastníkům během studie. Toto bude provedeno pomocí algoritmu Multimarker [43], který byl specificky vyvinut pro modelování příjmu potravy na základě biomarkerů [44]. Model vygeneruje kalibrační rovnici, kterou použijeme ke kalibraci dat 24hodinových dietních dotazníků a produkci biomarker-kalibrovaných odhadů příjmu jogurtu. Dále vyhodnotíme přesnost odhadů příjmu jogurtu získaných pomocí: a) kalibrační rovnice (pouze biomarkery), b) kalibrovaného 24hodinového dietního dotazníku (biomarkery × sebehlášený příjem), a c) nekalibrovaného 24hodinového dietního dotazníku (pouze sebehlášený příjem), porovnáním každého se skutečným příjmem poskytnutým ve studijních menu. Porovnáme Pearsonovy korelační koeficienty a jejich 95% intervaly spolehlivosti napříč metodami pomocí t-testů.