Identyfikacja obiektywnych biomarkerów konsumpcji jogurtu opartych na metabolomice (YOGBIO)

Amerykańska Agencja Żywności i Leków (FDA) niedawno uznała, że dowody naukowe są wystarczająco solidne, aby zatwierdzić wniosek o kwalifikowane oświadczenie zdrowotne dotyczące jogurtu i zmniejszonego ryzyka cukrzycy typu 2 (T2D). W przeciwieństwie do tego, Health Canada jeszcze nie zatwierdziła podobnego oświadczenia. Istniejące dowody pochodzą wyłącznie z prospektywnych badań kohortowych opartych na samodzielnie wypełnianych kwestionariuszach żywieniowych, które – mimo że są walidowane – są podatne na błędy losowe i systematyczne, co może obniżać jakość dowodów i utrudniać zatwierdzenie regulacyjne.

Biomarkery spożycia żywności są coraz częściej uznawane za cenne narzędzia zwiększające obiektywność w epidemiologii żywieniowej. Metabolomika, czyli kompleksowe profilowanie metabolitów osocza, jest uważana za złoty standard w identyfikacji takich biomarkerów. W kontekście nabiału, ważnym kamieniem milowym była identyfikacja sygnatury metabolomicznej spożycia jogurtu w dużej hiszpańskiej kohorcie. Ta sygnatura – obejmująca 27 metabolitów (np. C14:0 sfingomielinę, pochodzącą z kwasu mirystynowego) – była predykcyjna dla spożycia jogurtu w niezależnej amerykańskiej kohorcie i wiązała się z niższą częstością występowania T2D w obu populacjach. Jednak ponieważ ta sygnatura pochodziła z danych obserwacyjnych, brakowało jej specyficzności dla spożycia jogurtu.

Ten projekt ma na celu wypełnienie tej istotnej luki poprzez odkrycie specyficznych biomarkerów spożycia jogurtu i ich walidację zgodnie z uznanymi kryteriami.

Przeprowadzimy randomizowane, krzyżowe, dawkowo-reakcyjne badanie żywieniowe z udziałem 16 ogólnie zdrowych dorosłych (8 kobiet, 8 mężczyzn). Badanie będzie składać się z 4 ustalonych wcześniej diet, każda trwająca 7 dni i oddzielonych 1-tygodniowym okresem wypłukiwania. W 7. dniu każdej diety uczestnicy przejdą test mieszanego posiłku w INAF w celu pobrania próbek osocza w stanie poposiłkowym. 4 diety będą oparte na diecie bazowej bez nabiału, odzwierciedlającej wysokie przestrzeganie kanadyjskiego przewodnika żywieniowego, z następującymi dodatkami:

1. 125 g na 2380 kcal dziennie budyniu sojowego (tj. dieta bez jogurtu);
2. 90 g na 2380 kcal dziennie jogurtu (tj. 0,5 porcji referencyjnej jogurtu na 2380 kcal dziennie);
3. 175 g na 2380 kcal dziennie jogurtu (tj. 1 porcja referencyjna jogurtu na 2380 kcal dziennie);
4. 350 g na 2380 kcal dziennie jogurtu (tj. 2 porcje referencyjne na 2380 kcal dziennie).

Aby zapewnić, że zidentyfikowane biomarkery odzwierciedlają różnorodność jogurtów, przetestowane zostaną cztery rodzaje jogurtu:

a) jogurt naturalny regularny beztłuszczowy; b) jogurt naturalny regularny z 2% tłuszczu mlecznego; c) jogurt naturalny grecki beztłuszczowy; d) jogurt naturalny grecki z 2% tłuszczu mlecznego. Każdy rodzaj jogurtu zostanie przypisany czterem uczestnikom, którzy będą konsekwentnie spożywać ten sam typ przez całe badanie. Celem nie jest identyfikacja odrębnego biomarkera dla każdego rodzaju jogurtu, ale zapewnienie, że zidentyfikowany biomarker(e) uwzględnia różnorodność typów jogurtów. Dla interwencji bez jogurtu wszyscy uczestnicy będą spożywać ten sam budyń sojowy. Uczestnicy będą wykonywać cztery 7-dniowe interwencje w losowej kolejności. To projektowanie zapewnia, że wszelkie zaobserwowane zmiany w metabolomie osocza będą przypisane wyłącznie jogurtowi.

Podczas wszystkich czterech interwencji wszystkie posiłki i produkty spożywcze będą dostarczane przy użyciu 7-dniowego cyklicznego menu, jak robiono to wcześniej przez nasz zespół [28-30]. Dieta bazowa dla każdej interwencji będzie identyczna, bez nabiału (tj. wykluczająca wszystkie produkty mleczne i masło) i zaprojektowana tak, aby odzwierciedlać wysokie przestrzeganie kanadyjskiego przewodnika żywieniowego, z naciskiem na minimalnie przetworzoną żywność roślinną. Aby zwiększyć akceptowalność i przestrzeganie, menu będzie zawierać co najmniej jeden przepis z oficjalnej dokumentacji kanadyjskiego przewodnika żywieniowego każdego dnia [31, 32]. Doświadczony technik żywieniowy będzie przygotowywał diety, z dokładnym ważeniem wszystkich produktów spożywczych i składników z dokładnością do 0,1 g. W kontekście identyfikacji biomarkerów spożycia, jogurt naturalny został uznany za najbardziej odpowiedni wybór zamiast jogurtu smakowego. Jednak jogurt naturalny jest mniej smaczny ze względu na kwaśny smak. Aby temu zaradzić, dieta bazowa będzie zawierać dzienną porcję małych owoców, które uczestnicy będą instruowani, aby albo wymieszać z jogurtem (lub budyniem sojowym), albo spożywać obok. Ponieważ porcja owoców będzie standaryzowana i spożywana w stałych ilościach każdego dnia we wszystkich czterech interwencjach, nie wprowadzi to zakłóceń w procesie identyfikacji biomarkerów jogurtu. Uważamy to podejście również za korzystne dla zapewnienia zgodności podczas diety zawierającej budyń sojowy.

Przez cztery typy jogurtów i trzy poziomy spożycia, jogurt będzie średnio dostarczał 120 kcal/dzień, podobnie jak kontrolny budyń sojowy. Najniższy wkład kaloryczny wyniesie 40 kcal (jogurt naturalny regularny beztłuszczowy, 90 g/dzień), a najwyższy 240 kcal (jogurt naturalny grecki z 2% tłuszczu mlecznego; 350 g/dzień). Te kalorie zostaną dodane do diety bazowej 2380 kcal/dzień, aby stworzyć standaryzowane menu, które będzie średnio wynosić 2500 kcal/dzień przez cztery interwencje. Biorąc pod uwagę, że interwencje trwają tylko siedem dni, jest mało prawdopodobne, że różnica w kaloryczności jogurtów lub budyniu sojowego wpłynie na masę ciała lub wprowadzi zakłócenia. Proponowane podejście – dodawanie testowanych produktów do identycznej izoenergetycznej diety bazowej – jest optymalną strategią. Dla pojedynczego uczestnika jedyną różnicą między czterema dietami będzie zawartość jogurtu, co zapewnia, że wszelkie różnice w metabolomie osocza po diecie są wyłącznie przypisane jogurtowi. I odwrotnie, gdybyśmy zdecydowali się utrzymać podobną całkowitą zawartość kaloryczną diety bazowej we wszystkich czterech fazach, wymagane byłyby zmiany w diecie bazowej, co wprowadziłoby błąd w metabolomie osocza. Na początku, zapotrzebowanie energetyczne uczestników będzie szacowane przy użyciu walidowanych równań predykcyjnych [33], a całkowita zawartość energetyczna diet będzie odpowiednio dostosowana, aby spełnić te wymagania.

Podczas każdej z czterech 7-dniowych interwencji uczestnicy będą zobowiązani spożywać co najmniej trzy pełne posiłki w INAF pod nadzorem koordynatora badań klinicznych (CRC). Podczas tych wizyt otrzymają również swoje posiłki na następne 24 do 72 godzin. Uczestnicy będą instruowani, aby spożywać tylko dostarczone produkty spożywcze i spożywać wszystkie posiłki zgodnie z dostawą. Alkohol, suplementy witaminowe i naturalne produkty zdrowotne nie będą dozwolone. Herbata i kawa (≤2 filiżanki/dzień) będą dozwolone, bez dziennych wahań i bez mleka, śmietany lub cukru. Nieograniczona ilość wody będzie dozwolona. Uczestnicy będą instruowani, aby utrzymać swój zwykły poziom aktywności fizycznej na stałym poziomie przez cały protokół. W 7. dniu każdej diety uczestnicy przejdą ostry test mieszanego posiłku, aby uzyskać informacje o czasowej reaktywności biomarkerów jogurtu. Po 12-godzinnym poście uczestnicy przybędą do INAF o 7:30 rano. Posiłek testowy będzie składał się ze śniadaniowego smoothie zawierającego ten sam jogurt (lub budyń sojowy) dostarczany codziennie w poprzednich dniach. Próbki osocza będą pobierane na czczo (linia bazowa) oraz 1, 2, 4 i 6 godzin po posiłku. Próbki będą pobierane do probówek z EDTA i przechowywane w -80°C.

Podczas testu uczestnicy będą instruowani, aby wypełnić walidowany, samodzielnie administrowany, internetowy 24-godzinny wywiad żywieniowy (R24W), szczególnie walidowany do badań wśród dorosłych z Quebecu [34-40]. Pełna metodologia i walidacja stojąca za R24W jest opublikowana [34-40]. Krótko mówiąc, R24W prowadzi uczestników do wskazania wszystkich produktów spożywczych i napojów, w tym alkoholu, spożytych w poprzednim dniu. R24W umożliwia wybór spożytych produktów spożywczych i napojów poprzez przeglądanie ustrukturyzowanej listy produktów lub za pomocą wyszukiwarki. Zawiera również standaryzowane obrazy, aby pomóc w ocenie wielkości porcji. Te dane zostaną wykorzystane do porównania skuteczności R24W ze skutecznością biomarkerów jogurtu w szacowaniu prawdziwej zawartości jogurtu w diecie.

Uczestnicy i CRC nie mogą być zaślepieni co do przydziału diety. Jednak dokładna ilość jogurtu (lub budyniu sojowego) w dietach nie będzie ujawniana uczestnikom. Cztery diety będą losowo oznakowane literami (np. A=wysoki jogurt, B=soja, C=niski jogurt, D=umiarkowany jogurt). To podejście zminimalizuje błąd informacyjny dla wypełnienia R24W na końcu każdej interwencji. Każda interwencja będzie oddzielona 1-tygodniowym okresem wypłukiwania, aby zapewnić uczestnikom przerwę, zmniejszając ryzyko rezygnacji związanej z wielotygodniową interwencją. Podczas wypłukiwania uczestnicy będą instruowani, aby wrócić do swojej zwykłej diety. Nie przewidujemy żadnych efektów przeniesienia diety podczas wypłukiwania na kolejne 7-dniowe okresy interwencji w odniesieniu do identyfikacji biomarkerów spożycia jogurtu. Rzeczywiście, identyfikacja biomarkera spożycia jogurtu wykorzysta próbki osocza pobrane siódmego dnia każdej interwencji, zarówno na czczo, jak i w stanie poposiłkowym. Zatem jest wysoce nieprawdopodobne, aby biomarker z żywności spożywanej podczas okresu wypłukiwania wykazywał ostrą poposiłkową reaktywność oczekiwaną dla biomarkera spożycia jogurtu w proponowanym projekcie [27]. Całkowity udział w badaniu wyniesie 7 tygodni. Na koniec badania, dla każdego uczestnika, będziemy mieli łącznie 15 próbek osocza pobranych po spożyciu jogurtu (tj. 5 próbek x 3 poziomy spożycia jogurtu) i 5 próbek pobranych po diecie bez jogurtu, co daje łącznie 240 próbek po jogurcie i 80 bez jogurtu (razem=320).

Zgodność i oczekiwane rezygnacje: Zostanie dostarczony checklist do śledzenia dziennego spożycia żywności. Spożycie 3 pełnych posiłków w INAF pod nadzorem CRC wzmocni przestrzeganie protokołu. W naszych poprzednich badaniach o podobnym projekcie, 99% dostarczonej żywności zostało spożyte [28, 29], z tylko anegdotycznymi odchyleniami, wszystkie samodzielnie zgłoszone. Prof. Drouin-Chartier pierwotnie opracował i używał tego samego 7-dniowego menu w ramach w pełni żywieniowego RCT finansowanego przez CIHR z udziałem 50 dorosłych z heterozygotyczną hipercholesterolemią rodzinną, z interwencjami trwającymi 4 tygodnie. Zgodność była >99%, a dieta była bardzo doceniana, bez różnic między uczestnikami płci żeńskiej i męskiej. Przeprowadziliśmy wcześniej w pełni kontrolowane żywieniowe RCT o dłuższym czasie trwania (np. 5×4 tygodnie lub 3×6 tygodni) z bardziej inwazyjnymi procedurami (np. biopsje jelitowe) i dietami mniej typowymi dla kanadyjskich nawyków (np. śródziemnomorska, bez nabiału), a wskaźniki rezygnacji nigdy nie przekroczyły 20% [28, 29, 41]. Okresy wypłukiwania obniżają ryzyko rezygnacji. Nie przewidujemy problemów z zgodnością. Planujemy zrekrutować 20 uczestników, oczekując, że co najmniej 16 ukończy pełny protokół.

Procedury rekrutacji: Kryteria włączenia: wiek: 18-70 lat; BMI: 18-40 kg/m²; gotowość do codziennego spożywania jogurtu naturalnego przez 3 tygodnie; dla konsumentów kawy/herbaty, gotowość do spożywania tych napojów bez dodatku mleka, śmietany lub cukru przez 4 tygodnie. Kryteria wykluczenia: nietolerancja laktozy; oddawanie krwi w ciągu 2 miesięcy; ciężka choroba przewlekła lub trwające leczenie z powodu chorób takich jak infekcje, choroby autoimmunologiczne, nowotwory, cukrzyca typu 2, choroba Leśniowskiego-Crohna, celiakia, choroby wątroby lub nerek; historia ciężkiego nowotworu, choroby sercowo-naczyniowej lub operacji bariatrycznej; niestabilna masa ciała przez 3 miesiące; używanie nielegalnych narkotyków lub alkoholizm; palenie/wapowanie tytoniu/konopi (zapewnienie braku dziennych wahań i obiektywne raportowanie spożycia jest zbyt skomplikowane); alergie lub awersje do składników diet. Uczestnicy będą rekrutowani z obszaru Quebec City poprzez masowe e-maile z INAF (zasięg: >5000) i Université Laval (>20000). Zainteresowane osoby zostaną zaproszone do kontaktu z CRC w celu telefonicznej rozmowy kwalifikacyjnej. Kwalifikujące się osoby zostaną następnie zaproszone na osobistą sesję informacyjną, gdzie zostaną wyjaśnione pełne szczegóły protokołu. Zainteresowani zostaną poproszeni o świadomą zgodę. Następnie uczestnicy zostaną zrandomizowani, a wizyta wyjściowa zostanie zaplanowana. Zostanie wygenerowanych łącznie 10 różnych sekwencji randomizacji przy użyciu projektu Williama, aby zapewnić, że każda terapia następuje po każdej innej terapii równą liczbę razy. Każda sekwencja zostanie przypisana pojedynczemu uczestnikowi, w sposób specyficzny dla płci. Oczekujemy, że badanie będzie wymagało 20 tygodni do ukończenia. INAF jest siedzibą największej w Kanadzie jednostki badań klinicznych w dziedzinie żywienia (800 m²) i jednym z niewielu obiektów w kraju zdolnych do przeprowadzania w pełni kontrolowanych RCT. Posiada kuchnię metaboliczną, kafeterię, przestrzenie do pobierania próbek biologicznych, platformę elektroniczną do oceny żywieniowej, randomizacji i zarządzania uczestnikami oraz platformę metabolomiczną. Pracuje na pełny etat pielęgniarka badawcza. Centrum danych ULaval zapewnia bezpieczne przechowywanie i zdolności analityczne. Ta najnowocześniejsza infrastruktura jest kluczowa dla sukcesu projektu.

Profilowanie metabolomiczne: Po zakończeniu badania, próbki osocza będą przetwarzane na platformie metabolomicznej INAF przy użyciu czterech uzupełniających metod LC (jonizacja elektrorozpyleniowa dodatnia i ujemna) w celu określenia względnej obfitości ~22000 metabolitów. Obejmują one aminokwasy, cukry i małe kwasy organiczne (BEH Amide); metabolity polifenoli i małe peptydy (HSS T3); wolne kwasy tłuszczowe i kwasy żółciowe (CSH C18); oraz lipidy (BEH C8). Oprócz próbek osocza, przetworzymy również próbki każdego z 4 jogurtów i budyniu sojowego. Profilowanie metabolomiczne będzie prowadzone przy użyciu Thermo Vanquish U-HPLC sprzężonego z spektrometrem mas Thermo Fusion Tribrid Orbitrap lub Waters Acquity I-Class UPLC sprzężonego z Waters Synapt G2-Si, w zależności od metody. Surowe dane będą przetwarzane przy użyciu Compound Discoverer i Progenesis QI. Identyfikacja metabolitów będzie przeprowadzana przy użyciu stale rosnącego banku standardów analitycznych INAF (n=1000 związków, np. aminokwasy, metabolity pochodzenia jelitowego, kwasy żółciowe, związki fenolowe, kwasy tłuszczowe). Dodatkowe interesujące szczyty chromatograficzne przejdą przybliżoną identyfikację przy użyciu wielu baz danych spektralnych i molekularnych (np. mzCloud, HMDB). Oczekuje się, że profilowanie metabolomiczne zajmie 1 miesiąc.

Analizy statystyczne: Krok 1: identyfikacja potencjalnych biomarkerów spożycia jogurtu. Aby to zrobić, zamierzamy zidentyfikować wszystkie metabolity pozwalające odróżnić dietę zawierającą jogurt od diety bez jogurtu. Zmienne niezależne będą obejmować względną obfitość wszystkich metabolitów (n=22000) zmierzonych po każdej z czterech interwencji, biorąc pod uwagę próbki osocza dla każdego uczestnika z obecnego badania (320 obserwacji, z czego 80 bez jogurtu) oraz z naszego poprzedniego badania biomarkerów mleka i sera (n=284 próbki osocza bez jogurtu, przetworzone przy użyciu tych samych metod metabolomicznych; łącznie=604). Zmienną zależną będzie "obecność jogurtu w diecie" (tak/nie). Użyjemy algorytmu ekstremalnego wzmocnienia gradientowego (XGBoost) do trenowania modeli klasyfikacyjnych [42]. Iteracyjny proces będzie powtarzany n razy: (1) trenowanie modeli, (2) identyfikacja metabolitu o najlepszej zdolności predykcyjnej, obliczonej przez test permutacyjny, i (3) usunięcie tego metabolitu przed następną iteracją. Dla każdej iteracji, 25 modeli będzie trenowanych przy użyciu różnych podziałów uczestników na zestawy treningowe (80%; n=484 obserwacji) i testowe (20%; n=120). Iteracje będą kontynuowane, aż przedział ufności 95% czułości lub specyficzności modeli osiągnie 0,5 (zerowa moc predykcyjna algorytmu klasyfikacyjnego). Na końcu tego kroku, n usuniętych metabolitów będzie stanowić pulę potencjalnych biomarkerów spożycia jogurtu, które zostaną zachowane do kolejnych kroków. Kolejne kroki będą wykorzystywać standardowe podejścia statystyczne do testowania kluczowych cech zwalidowanego biomarkera spożycia żywności, zgodnie z propozycją FoodBALL. Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie poniższe testy będą przeprowadzane przy użyciu modeli mieszanych dla powtarzanych pomiarów, z względną obfitością metabolitów jako zmienną zależną. Modele będą skorygowane o wiek, płeć, wskaźnik masy ciała i całkowite dzienne kalorie z diety.

Krok 2, surowa reaktywność dawkowo-reakcyjna: Porównamy względną obfitość każdego potencjalnego biomarkera po dietach bez jogurtu i zawierających jogurt. Tylko metabolity, których obfitość wzrasta ze spożyciem jogurtu, przejdą do następnego kroku.

Krok 3, udoskonalona reaktywność dawkowo-reakcyjna: Porównamy względną obfitość metabolitów w trzech poziomach spożycia jogurtu testowanych w badaniu. Metabolity wykazujące istotny trend liniowy, z dietą bez jogurtu zakodowaną jako 0, zostaną zachowane.

Krok 4, reaktywność czasowa: Korzystając z danych z próbek osocza pobranych podczas ostrego testu posiłkowego, ocenimy, czy względna obfitość metabolitów wzrasta w czasie. Metabolity z większym obszarem pod krzywą (AUC) po spożyciu jogurtu w porównaniu z budyniem sojowym zostaną zachowane.

Krok 5, specyficzność: Aby potwierdzić specyficzność dla jogurtu, metabolity muszą wykazywać zwiększoną obfitość z jogurtem, ale nie z mlekiem lub serem. Aby to przetestować, użyjemy danych metabolomicznych wygenerowanych z poprzedniego grantu DFC posiadanego przez prof. Drouin-Chartier. W tym poprzednim projekcie, próbki osocza pobrane z 4 wcześniej przeprowadzonych krzyżowych RCT z pełnym żywieniem, mających na celu ocenę wpływu spożycia mleka lub sera przez 4 do 6 tygodni na czynniki ryzyka kardiometabolicznego, zostały użyte do identyfikacji biomarkerów metabolitów spożycia mleka i sera, oddzielnie. Ten zbiór danych obejmuje dane metabolomiczne z w pełni kontrolowanych diet zawierających mleko lub ser oraz diety bez nabiału dla 118 osób. Metabolity, których obfitość nie jest zwiększana przez mleko lub ser, zostaną zachowane na końcu tego kroku. To będzie przeprowadzone bez dodatkowych kosztów.

Krok 6, solidność: Wykorzystamy również dane metabolomiczne wygenerowane w naszym poprzednim grancie DFC. Będą one pochodzić z przekrojowej kohorty 200 dorosłych, którzy dostarczyli próbkę osocza na czczo i wypełnili trzy 24-godzinne wywiady żywieniowe (R24W) w tygodniu poprzedzającym pobranie osocza, w tym jeden raportujący o ich spożyciu diety w dniu przed pobraniem osocza. Uczestnicy zostaną podzieleni według mediany spożycia jogurtu. Tylko metabolity z większą obfitością u uczestników powyżej mediany zostaną zachowane. Ten krok również nie pociągnie za sobą dodatkowych kosztów.

Krok 7, wiarygodność: Ocenimy wiarygodność zachowanych metabolitów jako pochodzących z jogurtu na podstawie ich natury i struktur chemicznych, korzystając z Bazy Danych Składu Mleka. Dodatkowo, porównamy te metabolity z profilami metabolomicznymi czterech testowanych jogurtów. Po tym kroku, zachowane metabolity będą już spełniały istotne kryteria FoodBALL, aby być uważanymi za zwalidowane biomarkery spożycia jogurtu. Biorąc pod uwagę unikalne cechy matrycy jogurtu, jesteśmy przekonani o zidentyfikowaniu co najmniej jednego metabolitu spełniającego wszystkie kryteria. W naszej poprzedniej pracy, z powodzeniem zidentyfikowaliśmy jeden biomarker dla spożycia mleka (delta-walerobetaina, składnik specyficzny dla mleka) i dziewięć różnych innych dla spożycia sera.

Ocena skuteczności: Najpierw wytrenujemy model do szacowania spożycia jogurtu przy użyciu zidentyfikowanych biomarkerów, krzyżowo odnosząc ich względną obfitość ze znanymi poziomami spożycia jogurtu dostarczonymi uczestnikom podczas badania. To zostanie zrobione przy użyciu algorytmu Multimarker [43], który został specjalnie opracowany do modelowania spożycia żywności na podstawie biomarkerów [44]. Model wygeneruje równanie kalibracyjne, którego użyjemy do skalibrowania danych z 24-godzinnego wywiadu żywieniowego i wyprodukowania skalibrowanych biomarkerami szacunków spożycia jogurtu. Następnie ocenimy dokładność szacunków spożycia jogurtu uzyskanych przy użyciu: a) równania kalibracyjnego (same biomarkery), b) skalibrowanego 24-godzinnego wywiadu żywieniowego (biomarkery × samodzielnie zgłoszone spożycie) i c) nieskalibrowanego 24-godzinnego wywiadu żywieniowego (same samodzielnie zgłoszone spożycie), porównując każdy z prawdziwym spożyciem dostarczonym w menu badania. Porównamy współczynniki korelacji Pearsona i ich 95% przedziały ufności między metodami przy użyciu testów t.