Identificação de Biomarcadores Objetivos Baseados em Metabolómica do Consumo de Iogurte (YOGBIO)

A Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA considerou recentemente as evidências científicas suficientemente robustas para aprovar uma petição de alegação de saúde qualificada sobre iogurte e redução do risco de diabetes tipo 2 (DT2).
Em contraste, a Health Canada ainda não aprovou uma alegação semelhante.
As evidências existentes são derivadas exclusivamente de estudos de coorte prospectivos que dependem de questionários alimentares autorrelatados, que, apesar de validados, estão sujeitos a erros aleatórios e sistemáticos que podem comprometer a qualidade das evidências e dificultar a aprovação regulatória.

Os biomarcadores de ingestão alimentar são cada vez mais reconhecidos como ferramentas valiosas para aumentar a objetividade na epidemiologia nutricional.
A metabolómica, o perfilamento abrangente de metabólitos plasmáticos, é considerado o padrão de ouro para identificar esses biomarcadores.
No contexto dos laticínios, um grande marco foi a identificação de uma assinatura metabolómica da ingestão de iogurte numa grande coorte espanhola.
Esta assinatura, composta por 27 metabólitos (por exemplo, esfingomielina C14:0, derivada do ácido mirístico), foi preditiva da ingestão de iogurte numa coorte independente dos EUA e associada a uma menor incidência de DT2 em ambas as populações.
No entanto, como esta assinatura foi derivada de dados observacionais, faltava especificidade para a ingestão de iogurte.

Este projeto visa preencher esta lacuna crítica, descobrindo biomarcadores específicos da ingestão de iogurte e validando-os de acordo com critérios reconhecidos.

Realizaremos um ensaio alimentar randomizado, cruzado, de dose-resposta, envolvendo 16 adultos geralmente saudáveis (8 mulheres, 8 homens).
O ensaio consistirá em 4 dietas predeterminadas, cada uma com duração de 7 dias e separadas por um período de washout de 1 semana.
No 7.º dia de cada dieta, os participantes realizarão um teste de refeição mista no INAF para recolher amostras de plasma em estado pós-prandial.
As 4 dietas serão baseadas numa dieta de base sem laticínios, refletindo uma elevada adesão ao guia alimentar do Canadá, com as seguintes adições:

1. 125 g por 2.380 kcal por dia de um pudim à base de soja (ou seja, dieta sem iogurte);
2. 90 g por 2.380 kcal por dia de iogurte (ou seja, 0,5 dose de referência de iogurte por 2.380 kcal por dia);
3. 175 g por 2.380 kcal por dia de iogurte (ou seja, 1 dose de referência de iogurte por 2.380 kcal por dia);
4. 350 g por 2.380 kcal por dia de iogurte (ou seja, 2 doses de referência por 2.380 kcal por dia).

Para garantir que os biomarcadores identificados refletem a diversidade dos iogurtes, serão testadas quatro variedades de iogurte:

a) iogurte natural regular sem gordura; b) iogurte natural regular com 2% de gordura láctea; c) iogurte grego natural sem gordura; d) iogurte grego natural com 2% de gordura láctea.
Cada tipo de iogurte será atribuído a quatro participantes, que consumirão consistentemente o mesmo tipo ao longo do estudo.
O objetivo não é identificar um biomarcador distinto para cada tipo de iogurte, mas garantir que o(s) biomarcador(es) identificado(s) contabilizem a diversidade dos tipos de iogurte.
Para a intervenção sem iogurte, todos os participantes consumirão o mesmo pudim à base de soja.
Os participantes completarão as quatro intervenções de 7 dias em ordem aleatória.
Este desenho garante que quaisquer variações observadas no metaboloma plasmático serão atribuídas exclusivamente ao iogurte.

Durante as quatro intervenções, todas as refeições e alimentos serão fornecidos usando um menu cíclico de 7 dias, como feito anteriormente pela nossa equipa [28-30].
A dieta de base para cada intervenção será idêntica, sem laticínios (ou seja, excluindo todos os laticínios e manteiga), e desenhada para refletir uma elevada adesão ao guia alimentar do Canadá, com ênfase em alimentos vegetais minimamente processados.
Para aumentar a aceitabilidade e adesão, o menu incluirá pelo menos uma receita da documentação oficial do guia alimentar do Canadá por dia [31, 32].
Um técnico alimentar experiente preparará as dietas, com todos os alimentos e ingredientes pesados com precisão até ao 0,1 g mais próximo.
No contexto da identificação de biomarcadores de ingestão, o iogurte natural foi considerado a escolha mais apropriada em vez do iogurte aromatizado.
No entanto, o iogurte natural é menos palatável devido ao seu sabor ácido.
Para resolver isto, a dieta de base incluirá uma porção diária de pequenas frutas que os participantes serão instruídos a misturar no iogurte (ou pudim de soja) ou a consumir em conjunto.
Como a porção de fruta será padronizada e consumida em quantidades consistentes todos os dias nas quatro intervenções, não introduzirá confusão no processo de identificação de biomarcadores do iogurte.
Consideramos esta abordagem também favorável para garantir a conformidade durante a dieta contendo pudim à base de soja.

Através dos quatro tipos de iogurte e três níveis de ingestão, o iogurte contribuirá em média com 120 kcal/dia, tal como o pudim de controlo à base de soja.
A contribuição calórica mais baixa será de 40 kcal (iogurte natural regular sem gordura, 90 g/dia), e a mais alta será de 240 kcal (iogurte grego natural com 2% de gordura láctea; 350 g/dia).
Estas calorias serão adicionadas a uma dieta de base de 2.380 kcal/dia para criar um menu padronizado que terá uma média de 2.500 kcal/dia nas quatro intervenções.
Dado que as intervenções duram apenas sete dias, é improvável que a diferença na contribuição calórica dos iogurtes ou do pudim à base de soja afete o peso corporal ou introduza confusão.
A abordagem proposta – adicionar os alimentos testados a uma dieta de base isoenergética idêntica – é a estratégia ótima.
Para um único participante, a única diferença entre as quatro dietas será o conteúdo de iogurte, garantindo que quaisquer diferenças pós-dieta no metaboloma plasmático sejam atribuíveis exclusivamente ao iogurte.
Por outro lado, se optássemos por manter um conteúdo calórico total semelhante da dieta de base nas quatro fases, seriam necessárias alterações à dieta de base, o que introduziria viés no metaboloma plasmático.
No baseline, as necessidades energéticas dos participantes serão estimadas usando equações preditivas validadas [33], e o conteúdo energético total das dietas será ajustado em conformidade para atender a essas necessidades.

Durante cada uma das quatro intervenções de 7 dias, os participantes terão de consumir pelo menos três refeições completas no INAF sob a supervisão do coordenador de pesquisa clínica (CRC).
Durante estas visitas, também receberão as suas refeições para as próximas 24 a 72 horas.
Os participantes serão instruídos a consumir apenas os alimentos fornecidos e a consumir todas as refeições como fornecidas.
Álcool, suplementos vitamínicos e produtos naturais de saúde não serão permitidos.
Chá e café (≤2 chávenas/dia) serão permitidos, sem flutuações diárias e sem leite, natas ou açúcar.
Quantidade ilimitada de água será permitida.
Os participantes serão instruídos a manter o seu nível habitual de atividade física estável durante todo o protocolo.
No 7.º dia de cada dieta, os participantes realizarão um teste agudo de refeição mista para informar sobre a responsividade temporal dos biomarcadores do iogurte.
Após um jejum de 12 horas, os participantes chegarão ao INAF às 7h30.
A refeição de teste consistirá num batido de pequeno-almoço contendo o mesmo iogurte (ou pudim à base de soja) fornecido diariamente nos dias anteriores.
As amostras de plasma serão recolhidas no baseline (jejum) e 1, 2, 4 e 6 horas após a refeição.
As amostras serão recolhidas em tubos EDTA e armazenadas a -80°C.

Durante o teste, os participantes serão instruídos a completar um recall alimentar de 24 horas autoadministrado e validado baseado na web (o R24W), especificamente validado para pesquisa entre adultos do Quebec [34-40].
A metodologia completa e a validação por trás do R24W são publicadas [34-40].
Brevemente, o R24W orienta os participantes a indicar todos os alimentos e bebidas, incluindo álcool, consumidos no dia anterior.
O R24W permite selecionar alimentos e bebidas consumidos navegando por uma lista estruturada de alimentos ou usando um motor de busca.
Também contém imagens padronizadas para ajudar a avaliar o tamanho das porções.
Estes dados serão usados para comparar o desempenho do R24W com o dos biomarcadores do iogurte na estimativa do verdadeiro conteúdo de iogurte da dieta.

Os participantes e o CRC não podem estar cegos para a alocação da dieta.
No entanto, a quantidade exata de iogurte (ou pudim à base de soja) nas dietas não será divulgada aos participantes.
As quatro dietas serão aleatoriamente rotuladas com letras (por exemplo, A=alto iogurte, B=soja, C=baixo iogurte, D=iogurte moderado).
Esta abordagem minimizará o viés de informação para a conclusão do R24W no final de cada intervenção.
Cada intervenção será separada por um período de washout de 1 semana, para dar aos participantes uma pausa, reduzindo o risco de desistências associadas a uma intervenção de várias semanas.
Durante o washout, os participantes serão instruídos a retomar a sua dieta habitual.
Não antecipamos quaisquer efeitos de arrastamento da dieta durante o washout nos períodos de intervenção subsequentes de 7 dias em relação à identificação de biomarcadores de ingestão de iogurte.
De facto, a identificação do biomarcador de ingestão de iogurte aproveitará as amostras de plasma recolhidas no sétimo dia de cada intervenção, tanto em estado de jejum como pós-prandial.
Assim, é altamente improvável que um biomarcador de alimento consumido durante o período de washout exiba a responsividade pós-prandial aguda esperada para o biomarcador de ingestão de iogurte sob o desenho proposto [27].
A participação total no ensaio será de 7 semanas.
No final do ensaio, para cada participante, teremos um total de 15 amostras de plasma recolhidas após o consumo de iogurte (ou seja, 5 amostras x 3 níveis de ingestão de iogurte) e 5 amostras recolhidas após a dieta sem iogurte, para um total de 240 amostras pós-iogurte e 80 sem iogurte (total=320).

Conformidade e desistências esperadas: Será fornecido uma checklist para monitorizar o consumo alimentar diário.
Ter 3 refeições completas consumidas no INAF sob a supervisão do CRC reforçará a adesão ao protocolo.
Nos nossos estudos anteriores com desenhos semelhantes, 99% dos alimentos fornecidos foram consumidos [28, 29], com apenas desvios anedóticos, todos autorrelatados.
O Prof. Drouin-Chartier originalmente desenvolveu e usou o mesmo menu de 7 dias num RCT totalmente alimentado financiado pelo CIHR em 50 adultos com hipercolesterolemia familiar heterozigótica, com intervenções com duração de 4 semanas.
A conformidade foi >99% e a dieta foi muito apreciada, sem diferenças entre participantes femininos e masculinos.
Realizámos anteriormente RCTs alimentares totalmente controlados de maior duração (por exemplo, 5×4 semanas ou 3×6 semanas) com procedimentos mais invasivos (por exemplo, biópsias intestinais) e dietas menos típicas dos hábitos canadianos (por exemplo, mediterrânica, sem laticínios), e as taxas de desistência nunca excederam 20% [28, 29, 41].
Os períodos de washout reduzem o risco de desistência.
Antecipamos nenhum problema de conformidade.
Planeamos recrutar 20 participantes, esperando que pelo menos 16 completem o protocolo completo.

Procedimentos de recrutamento: Critérios de inclusão: idade: 18-70 anos; IMC: 18-40 kg/m²; disponibilidade para consumir iogurte natural diariamente durante 3 semanas; para consumidores de café/chá, disponibilidade para consumir estas bebidas sem leite, natas ou açúcar adicionados durante 4 semanas.
Critérios de exclusão: intolerância à lactose; doação de sangue nos últimos 2 meses; doença crónica grave ou tratamento contínuo para condições como infeções, doenças autoimunes, cancro, diabetes tipo 2, doença de Crohn, doença celíaca, doenças hepáticas ou renais; histórico de cancro grave, doença cardiovascular ou cirurgia bariátrica; peso corporal instável durante 3 meses; uso de drogas ilícitas ou alcoolismo; tabagismo/vaping de tabaco/cannabis (garantir que não haja flutuações dia-a-dia e relato objetivo do consumo é demasiado complexo); alergias ou aversões a componentes das dietas.
Os participantes serão recrutados da área da Cidade do Quebec através de emails em massa do INAF (alcance: >5.000) e da Université Laval (>20.000).
Indivíduos interessados serão convidados a contactar o CRC para uma chamada telefónica de triagem.
Indivíduos elegíveis serão então convidados para uma sessão de informação presencial, onde os detalhes completos do protocolo serão explicados.
Os interessados serão solicitados a fornecer consentimento informado.
Depois, os participantes serão randomizados, e uma visita de baseline será agendada.
Um total de 10 sequências de randomização diferentes serão geradas usando o desenho de William para garantir que cada tratamento segue todos os outros tratamentos um número igual de vezes.
Cada sequência será atribuída a um único participante, de forma específica por sexo.
Antecipamos que o ensaio exigirá 20 semanas para ser concluído.
O INAF é a casa da maior unidade de pesquisa clínica em nutrição do Canadá (800 m²), e uma das poucas instalações no país capaz de realizar RCTs totalmente controlados.
Possui uma cozinha metabólica, cafetaria, espaços para recolha de espécimes biológicos, uma plataforma eletrónica para avaliação dietética, randomização e gestão de participantes, e uma plataforma de metabolómica.
Uma enfermeira de pesquisa em tempo integral está na equipa.
O centro de dados da ULAval garante armazenamento seguro e capacidade analítica.
Esta infraestrutura de ponta é fundamental para o sucesso do projeto.

Perfilamento metabolómico: Uma vez concluído o ensaio, as amostras de plasma serão processadas na plataforma de metabolómica do INAF usando quatro métodos de LC complementares (ionização por eletrospray positiva e negativa) para determinar a abundância relativa de ~22.000 metabólitos.
Estes incluem aminoácidos, açúcares e ácidos orgânicos pequenos (BEH Amide); metabólitos de polifenóis e peptídeos pequenos (HSS T3); ácidos gordos livres e ácidos biliares (CSH C18); e lípidos (BEH C8).
Além das amostras de plasma, também processaremos amostras de cada um dos 4 iogurtes e do pudim de soja.
O perfilamento metabolómico será realizado usando um Thermo Vanquish U-HPLC acoplado a um espectrómetro de massa Thermo Fusion Tribrid Orbitrap ou um Waters Acquity I-Class UPLC acoplado a um Waters Synapt G2-Si, dependendo do método.
Os dados brutos serão processados usando o Compound Discoverer e o Progenesis QI.
A identificação de metabólitos será realizada usando o banco de padrões analíticos em constante crescimento do INAF (n=1.000 compostos, por exemplo, aminoácidos, metabólitos derivados do intestino, ácidos biliares, compostos fenólicos, ácidos gordos).
Picos cromatográficos adicionais de interesse passarão por identificação putativa usando múltiplas bases de dados espectrais e moleculares (por exemplo, mzCloud, HMDB).
Espera-se que o perfilamento metabolómico leve 1 mês.

Análises estatísticas: Passo 1: identificação de potenciais biomarcadores de ingestão de iogurte.
Para isso, pretendemos identificar todos os metabólitos que permitam distinguir entre uma dieta contendo iogurte e uma dieta sem iogurte.
As variáveis independentes incluirão a abundância relativa de todos os metabólitos (n=22.000) medidos após cada uma das quatro intervenções, considerando amostras de plasma para cada participante do presente ensaio (320 observações, das quais 80 são sem iogurte), e do nosso estudo anterior de biomarcadores de leite e queijo (n=284 amostras de plasma sem iogurte, processadas usando os mesmos métodos de metabolómica; total=604).
A variável dependente será "presença de iogurte na dieta" (sim/não).
Usaremos o algoritmo de gradient boosting extremo (XGBoost) para treinar modelos de classificação [42].
Um processo iterativo será repetido n vezes: (1) treinar os modelos, (2) identificar o metabólito com a melhor capacidade preditiva, calculada por teste de permutação, e (3) remover este metabólito antes da próxima iteração.
Para cada iteração, 25 modelos serão treinados usando diferentes divisões de participantes em conjuntos de treino (80%; n=484 observações) e teste (20%; n=120).
As iterações continuarão até que o intervalo de confiança de 95% da sensibilidade ou especificidade dos modelos atinja 0,5 (poder preditivo nulo de um algoritmo de classificação).
No final deste passo, os n metabólitos removidos constituirão o conjunto de potenciais biomarcadores de ingestão de iogurte, que serão retidos para os passos subsequentes.
Os passos subsequentes aproveitarão abordagens estatísticas padrão para testar as características-chave de um biomarcador validado de ingestão alimentar, conforme proposto pelo FoodBALL.
A menos que especificado de outra forma, todos os testes seguintes serão realizados usando modelos mistos para medidas repetidas, com a abundância relativa de metabólitos como variável dependente.
Os modelos serão ajustados para idade, sexo, índice de massa corporal e calorias totais diárias da dieta.

Passo 2, dose-responsividade bruta: Compararemos a abundância relativa de cada biomarcador potencial após dietas sem iogurte e com iogurte.
Apenas metabólitos cuja abundância aumenta com o consumo de iogurte avançarão para o próximo passo.

Passo 3, dose-responsividade refinada: Compararemos a abundância relativa de metabólitos nos três níveis de ingestão de iogurte testados no estudo.
Metabólitos mostrando uma tendência linear significativa, com a dieta sem iogurte codificada como 0, serão retidos.

Passo 4, responsividade temporal: Usando dados de amostras de plasma recolhidas durante a refeição de teste aguda, avaliaremos se a abundância relativa de metabólitos aumenta ao longo do tempo.
Metabólitos com uma maior área sob a curva (AUC) após a ingestão de iogurte em comparação com o pudim à base de soja serão retidos.

Passo 5, especificidade: Para confirmar especificidade para iogurte, os metabólitos devem mostrar aumento de abundância com iogurte, mas não com leite ou queijo.
Para testar isto, usaremos dados de metabolómica gerados a partir da bolsa DFC anterior detida pelo Prof. Drouin-Chartier.
Neste projeto anterior, amostras de plasma recolhidas de 4 RCTs cruzados anteriormente realizados com configurações de alimentação total visando avaliar o impacto da ingestão de leite ou queijo durante 4 a 6 semanas sobre fatores de risco cardiometabólicos foram usadas para identificar metabólitos biomarcadores de ingestão de leite e queijo, separadamente.
Este conjunto de dados compreende dados de metabolómica de dietas totalmente controladas contendo leite ou queijo e uma dieta sem laticínios para 118 indivíduos.
Metabólitos cuja abundância não é aumentada por leite ou queijo serão retidos no final deste passo.
Isto será realizado sem custos adicionais.

Passo 6, robustez: Também usaremos dados de metabolómica gerados na nossa bolsa DFC passada.
Estes virão de uma coorte transversal de 200 adultos que forneceram uma amostra de plasma em jejum e completaram três recalls dietéticos de 24 horas (R24W) na semana anterior à amostragem de plasma, incluindo um relatando as suas ingestões dietéticas no dia anterior à amostragem de plasma.
Os participantes serão divididos pela mediana de ingestão de iogurte.
Apenas metabólitos com maior abundância em participantes acima da mediana serão retidos.
Este passo também não incorrerá em custos adicionais.

Passo 7, plausibilidade: Avaliaremos a plausibilidade dos metabólitos retidos como originários do iogurte com base na sua natureza e estruturas químicas, usando a Base de Dados de Composição do Leite.
Além disso, compararemos estes metabólitos com os perfis metabolómicos dos quatro iogurtes testados.
Após este passo, os metabólitos retidos já terão satisfeito os critérios essenciais do FoodBALL para serem considerados biomarcadores validados de ingestão de iogurte.
Dadas as características únicas da matriz do iogurte, estamos confiantes em identificar pelo menos um metabólito que atenda a todos os critérios.
No nosso trabalho anterior, identificámos com sucesso um biomarcador para ingestão de leite (delta-valerobetaina, um componente específico do leite) e nove outros diferentes para ingestão de queijo.

Avaliação de desempenho: Primeiro treinaremos um modelo para estimar a ingestão de iogurte usando os biomarcadores identificados, cruzando referências da sua abundância relativa com os níveis conhecidos de ingestão de iogurte fornecidos aos participantes durante o ensaio.
Isto será feito usando o algoritmo Multimarker [43], que foi especificamente desenvolvido para modelar a ingestão alimentar com base em biomarcadores [44].
O modelo gerará uma equação de calibração que usaremos para calibrar dados de recall dietético de 24 horas e produzir estimativas calibradas por biomarcadores da ingestão de iogurte.
Em seguida, avaliaremos a precisão das estimativas de ingestão de iogurte obtidas usando: a) a equação de calibração (apenas biomarcadores), b) o recall dietético de 24 horas calibrado (biomarcadores × ingestão autorrelatada), e c) o recall dietético de 24 horas não calibrado (apenas ingestão autorrelatada), comparando cada um com a ingestão verdadeira fornecida nos menus do estudo.
Compararemos coeficientes de correlação de Pearson e seus intervalos de confiança de 95% entre métodos usando testes t.