単一筋線維におけるミトコンドリアDNA定量化の新技術開発 (DIGITAL_MITO)
ミトコンドリア病における意義不明の変異を解釈するツールとして、単一筋繊維におけるミトコンドリアDNA定量化の新技術開発
ミトコンドリア病（MDs）は、最も一般的な代謝疾患です。 その臨床的および遺伝的多様性の大きさから、診断は核遺伝子またはミトコンドリアDNA（mtDNA）における病原性バリアントの同識別に完全に依存しています。 しかし、現在でも、患者の50％が確定診断を得られていません。 次世代シーケンシング（NGS）の登場により診断率は向上しましたが、多くの同定されたバリアントは意義不明（VUS）のままであり、確定診断を妨げています。 したがって、これらの新たに同定された希少バリアントの臨床的解釈は、大きな課題となっています。
MDsの文脈において、mtDNAバリアントの病原性に関する主要な基準の一つは、ヘテロプラズミーレベルと組織または細胞の関与との良好な相関です。 ヘテロプラズミーとは、同じ細胞または組織内で、変異したmtDNA分子と非変異mtDNA分子が共存することを指します。 病原性mtDNAバリアントはほとんどの場合ヘテロプラズミーを示し、最も影響を受けた組織では変異mtDNAの割合が高くなります。 MDs患者の筋生検では、筋線維がシトクロムcオキシダーゼ（COX）酵素欠損（COX陰性線維）を示すことがあり、ミトコンドリア呼吸鎖（MRC）の機能不全を反映しています。 単一線維分析により、レーザーマイクロダイセクションによって筋線維を分離し、その中のバリアントのヘテロプラズミーレベルを定量することが可能です。 欠損のない線維（COX陽性線維）とは対照的に、COX陰性線維における高いヘテロプラズミーレベルの存在は、バリアントの病原性を支持する強力な証拠となります。 以前のプロジェクトでは、2つのバリアント定量技術（PCR-RFLPおよびNGS）をテストしましたが、これらの方法は依然として労力がかかりすぎるかコストが高く、日常診療での維持が困難です。
このパイロット研究は、デジタルPCRを用いてヘテロプラズミーレベルを定量する新しい方法の開発を目的としています。 より迅速で費用対効果の高いこのアプローチは、技術的実施を簡素化し、分析コストを削減することで、臨床診療への統合を容易にする可能性があります。 最初に、前研究（AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45）で同定された病原性バリアントを保有する2名の患者の血液サンプルから抽出したDNAを用いて、デジタルPCRの検証から始まる実現可能性研究を実施します。 この検証では、ヘテロプラズミー定量についてデジタルPCRとPCR-RFLP法を比較し、技術の信頼性と再現性を評価します。 検証が達成された後、デジタルPCRを同じ患者のマイクロダイセクションされた筋線維から抽出したDNAでテストし、PCR-RFLP結果との比較により、単一線維レベルでの実現可能性を評価します。 単一線維レベルでの実現可能性が確認された場合、この方法は、意義不明のバリアントが同定され、COX陰性線維を含む筋生検が利用可能な、ミトコンドリア病リファレンスセンターからの新たな4名の患者でテストされます。 異なる組織間でのヘテロプラズミーレベルを評価するために、追加のサンプル（血液、尿、口腔スワブ）が収集されます。 検証されれば、この技術はより多くの患者に適用され、ミトコンドリア病の診断戦略に統合される可能性があります。
さらに、デジタルPCRは、MDs患者のモニタリングに不可欠なバイオマーカーであるmtDNAコピー数の定量にも使用できます。 この目的のために、mtDNAは数千のナノウェルに分配され、核DNAプローブを内部対照として、陽性区画から発せられる蛍光信号をカウントすることにより絶対定量が得られます。 この検証は、同じ血液サンプルと筋線維を用いて、デジタルPCRの結果を参照法である定量PCR（qPCR）で得られた結果と比較することにより実施されます。
この研究の主な目的は、既存の方法を簡素化することにより診断の長期化を減らすことです。 加えて、mtDNAコピー数を定量するためのデジタルPCRの応用は、特に患者モニタリングのバイオマーカーおよび臨床試験の開発として、新たな展望を提供する可能性があります。
調査の概要
研究の種類
入学 (推定)
段階
- 適用できない
連絡先と場所
研究連絡先
- 名前：Cécile Rouzier, MD-PhD
- 電話番号：+33 (0)4 92 03 62 43
- メール：rouzier.c@chu-nice.fr
研究場所
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Bron、フランス、69500
- Groupement Hospitalier Est Hospices civils de Lyon - Service de génétique médicale
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コンタクト：
- Pauline Monin, Ph
- 電話番号：+33 (0)4 27 85 55 73
- メール：pauline.monin@chu-lyon.fr
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Montpellier、フランス、34295
- Hôpital Gui de Chauliac - Service de Neurologie
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コンタクト：
- Cecilia Marelli, Ph
- 電話番号：+33 (0)4 67 33 60 29
- メール：c-marelli@chu-montpellier.fr
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Provence-Alpes-Côte d'Azur Region
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Nice、Provence-Alpes-Côte d'Azur Region、フランス、06202
- CHU de Nice - Service de Génétique Médicale
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コンタクト：
- Cécile Rouzier, MD-PhD
- 電話番号：+33 (0)4 92 03 62 43
- メール：rouzier.c@chu-nice.fr
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コンタクト：
- Claire Hoarau
- 電話番号：+33 (6)4 92 03 94 05
- メール：hoarau.c@chu-nice.fr
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参加基準
適格基準
就学可能な年齢
- 子
- 大人
- 高齢者
健康ボランティアの受け入れ
説明
包含基準：
- 成人または未成年の患者、散発性または孤立症例
- インフォームド・コンセントの署名。未成年患者の場合：合理的な期間内に片方の親の同意が得られない場合を除き、両親または親権保持者の署名
- 社会保障制度への加入
ミトコンドリア疾患参照センターの臨床医が評価した、少なくとも以下のいずれかに基づくミトコンドリア疾患の疑い：
- ミトコンドリア疾患を示唆する臨床症状（症状の特異的な組み合わせ、MELASなどの特定症候群、筋力低下、眼瞼下垂など）および/または
- 呼吸鎖関与を示す代謝検査所見および/または
- 筋生検における1つ以上の呼吸鎖複合体の欠損の同定。
- 以前に特定された意義不明のミトコンドリアDNA変異（VUS）を有する患者。
- 筋生検の組織学的分析で、少なくとも5本のCOX陰性線維が確認されること。
- 筋生検標本が利用可能であり、病理検査室からスライドを回収できること。
除外基準：
- 研究同意書への署名を拒否すること。
- 研究参加以外の目的で医療または社会施設に入院している個人。
- 法的保護下にある成人（後見、保佐）
- 妊娠中または授乳中の女性
研究計画
研究はどのように設計されていますか？
デザインの詳細
- 主な目的：診断
- 割り当て：なし
- 介入モデル：単一グループの割り当て
- マスキング：なし（オープンラベル）
武器と介入
参加者グループ / アーム |
介入・治療 |
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実験的：ミトコンドリア疾患群
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この介入は、デジタルPCR（dPCR）を用いてミトコンドリアDNA（mtDNA）のヘテロプラスミーレベルとmtDNAコピー数を定量化することから構成されます。 dPCRは、血液、尿、および口腔（唾液）サンプルから抽出したDNA、ならびに筋生検から得られたレーザーマイクロダイセクションによる単一筋線維から抽出したDNAに対して実施されます。 この方法は、参照技術（ヘテロプラスミーに対するPCR-RFLPおよびmtDNAコピー数に対する定量PCR）との比較によって検証され、その精度と再現性を評価します。 次に、dPCRは意義不明のバリアントを保有する患者に適用され、ヘテロプラスミーレベルと組織関与との相関を評価し、それによってバリアントの病原性評価を支援します。 この介入は、すべてのサンプルが日常的な臨床ケアの一環として収集されるため、追加の侵襲的手順を伴いません。 |
この研究は何を測定していますか？
主要な結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
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診断収率を向上させるために、単一筋線維におけるバリアントのヘテロプラスミーレベルを定量化する新しいデジタルPCR技術を検証する。
時間枠：選定訪問
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デジタルPCRとPCR-RFLPによる2人の患者における既知の病原性バリアントのヘテロプラスミーレベル定量結果の一致
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選定訪問
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二次結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
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ミトコンドリアDNA（mtDNA）コピー数を定量化するための新しいデジタルPCR技術の検証
時間枠：選定訪問
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デジタルPCRとqPCRの結果の間のミトコンドリアDNAコピー数の定量に関する一致度は、Mann-Whitney検定によって評価され、p値 > 0.05を示し、2つの技術の間に差がないことを示している
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選定訪問
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協力者と研究者
研究記録日
主要日程の研究
研究開始 (推定)
一次修了 (推定)
研究の完了 (推定)
試験登録日
最初に提出
QC基準を満たした最初の提出物
最初の投稿 (実際)
学習記録の更新
投稿された最後の更新 (実際)
QC基準を満たした最後の更新が送信されました
最終確認日
詳しくは
この情報は、Web サイト clinicaltrials.gov から変更なしで直接取得したものです。研究の詳細を変更、削除、または更新するリクエストがある場合は、register@clinicaltrials.gov。 までご連絡ください。 clinicaltrials.gov に変更が加えられるとすぐに、ウェブサイトでも自動的に更新されます。