Opracowanie nowej techniki ilościowego oznaczania mitochondrialnego DNA w pojedynczych włóknach mięśniowych (DIGITAL_MITO)

Choroby mitochondrialne (CM) są najczęstszymi zaburzeniami metabolicznymi. Ze względu na ich dużą heterogeniczność kliniczną i genetyczną, ich diagnoza opiera się wyłącznie na identyfikacji wariantów patogennych w genach jądrowych lub w mitochondrialnym DNA (mtDNA). Jednak do tej pory 50% chorych pacjentów pozostaje bez ostatecznej diagnozy. Pojawienie się sekwencjonowania nowej generacji (NGS) poprawiło wydajność diagnostyczną, ale wiele zidentyfikowanych wariantów pozostaje o niepewnym znaczeniu (VUS), uniemożliwiając ostateczną diagnozę. Interpretacja kliniczna tych nowo zidentyfikowanych rzadkich wariantów stanowi zatem poważne wyzwanie.

W kontekście CM jednym z głównych kryteriów patogenności wariantu mtDNA jest dobra korelacja między poziomem heteroplazmii a zaangażowaniem tkankowym lub komórkowym. Heteroplazmia odnosi się do współistnienia, w tej samej komórce lub tkance, zmutowanych i niezmutowanych cząsteczek mtDNA. Patogenne warianty mtDNA są najczęściej heteroplazmatyczne, przy czym najbardziej dotknięte tkanki zawierają wyższy proporcjonalnie zmutowanego mtDNA. W biopsjach mięśni pacjentów z CM, włókna mięśniowe mogą wykazywać niedobór enzymatyczny cytochromu c oksydazy (COX) (włókna COX-ujemne), odzwierciedlając dysfunkcję mitochondrialnego łańcucha oddechowego (MRC). Analiza pojedynczego włókna umożliwia izolację włókien mięśniowych poprzez mikrodysekcję LASER-em i ilościowe określenie poziomu heteroplazmii wariantu w ich obrębie. Obecność wysokiego poziomu heteroplazmii we włóknach COX-ujemnych, w przeciwieństwie do włókien bez niedoboru (włókna COX-dodatnie), jest silnym dowodem wspierającym patogenność wariantu. W poprzednich projektach przetestowaliśmy dwie techniki ilościowego oznaczania wariantów (PCR-RFLP i NGS), ale metody te pozostają zbyt pracochłonne lub kosztowne i dlatego trudne do utrzymania w praktyce rutynowej.

Niniejsze badanie pilotażowe ma na celu opracowanie nowej metody ilościowego oznaczania poziomów heteroplazmii przy użyciu cyfrowego PCR. Szybsze i tańsze, to podejście może uprościć wdrożenie techniczne i obniżyć koszty analizy, ułatwiając tym samym jego integrację z praktyką kliniczną. Początkowo, badanie wykonalności rozpocznie się od walidacji cyfrowego PCR na DNA wyizolowanym z próbek krwi dwóch pacjentów noszących warianty patogenne zidentyfikowane w poprzednim badaniu (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Walidacja ta porówna cyfrowy PCR z metodą PCR-RFLP w ilościowym oznaczaniu heteroplazmii oraz oceni wiarygodność i powtarzalność techniki. Po osiągnięciu walidacji, cyfrowy PCR zostanie przetestowany na DNA wyizolowanym z mikrodysponowanych włókien mięśniowych tych samych pacjentów, aby ocenić jego wykonalność na poziomie pojedynczego włókna, z porównaniem do wyników PCR-RFLP. Jeśli wykonalność na poziomie pojedynczego włókna zostanie potwierdzona, metoda zostanie następnie przetestowana u czterech nowych pacjentów z Referencyjnego Centrum Chorób Mitochondrialnych, u których zidentyfikowano warianty o niepewnym znaczeniu i dla których dostępne są biopsje mięśni z włóknami COX-ujemnymi. Dodatkowe próbki (krew, mocz i wymazy z jamy ustnej) zostaną pobrane w celu oceny poziomów heteroplazmii w różnych tkankach. Jeśli zostanie zwalidowana, technika ta może być zastosowana u większej liczby pacjentów i zintegrowana ze strategią diagnostyczną chorób mitochondrialnych.

Ponadto, cyfrowy PCR mógłby również być używany do ilościowego oznaczania liczby kopii mtDNA, niezbędnego biomarkera do monitorowania pacjentów z CM. W tym celu, mtDNA jest dzielone na tysiące nanowgłębień, a ilościowe oznaczanie absolutne uzyskuje się poprzez zliczanie sygnałów fluorescencyjnych emitowanych przez pozytywne przedziały, przy czym sonda DNA jądrowego służy jako kontrola wewnętrzna. Ta walidacja zostanie przeprowadzona przy użyciu tych samych próbek krwi i włókien mięśniowych, poprzez porównanie wyników cyfrowego PCR z wynikami uzyskanymi przy użyciu metody referencyjnej, ilościowego PCR (qPCR).

Głównym celem tego badania jest skrócenie diagnostycznych odysei poprzez uproszczenie istniejących metod. Ponadto, zastosowanie cyfrowego PCR do ilościowego oznaczania liczby kopii mtDNA może otworzyć nowe perspektywy, szczególnie jako biomarker do monitorowania pacjentów i rozwoju badań klinicznych.