Разработка новой методики количественного определения митохондриальной ДНК в отдельных мышечных волокнах (DIGITAL_MITO)

Митохондриальные заболевания (МЗ) являются наиболее распространенными метаболическими нарушениями. Ввиду их значительной клинической и генетической гетерогенности, их диагностика основывается исключительно на выявлении патогенных вариантов в ядерных генах или в митохондриальной ДНК (мтДНК). Однако на сегодняшний день 50% пациентов остаются без окончательного диагноза. Появление секвенирования следующего поколения (NGS) улучшило диагностическую эффективность, но многие выявленные варианты остаются вариантами с неопределенным значением (VUS), что препятствует постановке окончательного диагноза. Таким образом, клиническая интерпретация этих вновь выявленных редких вариантов представляет собой серьезную проблему.

В контексте МЗ одним из основных критериев патогенности варианта мтДНК является хорошая корреляция между уровнем гетероплазмии и вовлечением ткани или клетки. Гетероплазмия означает сосуществование, в пределах одной клетки или ткани, мутировавших и немутировавших молекул мтДНК. Патогенные варианты мтДНК чаще всего являются гетероплазменными, причем наиболее пораженные ткани содержат более высокую долю мутировавшей мтДНК. В мышечных биоптатах пациентов с МЗ мышечные волокна могут демонстрировать ферментативный дефицит цитохром с оксидазы (COX) (COX-отрицательные волокна), что отражает дисфункцию митохондриальной дыхательной цепи (MRC). Анализ отдельных волокон позволяет изолировать мышечные волокна с помощью ЛАЗЕРНОЙ микродиссекции и количественно определить уровень гетероплазмии варианта внутри них. Наличие высокого уровня гетероплазмии в COX-отрицательных волокнах, в отличие от волокон без дефицита (COX-положительные волокна), является убедительным доказательством патогенности варианта. В предыдущих проектах мы тестировали две техники количественного определения вариантов (ПЦР-ПДРФ и NGS), но эти методы остаются слишком трудоемкими или дорогостоящими и, следовательно, сложными для поддержания в рутинной практике.

Это пилотное исследование направлено на разработку нового метода количественного определения уровней гетероплазмии с помощью цифровой ПЦР. Более быстрый и менее затратный, этот подход может упростить техническую реализацию и снизить стоимость анализа, тем самым облегчив его интеграцию в клиническую практику. Первоначально исследование осуществимости начнется с валидации цифровой ПЦР на ДНК, экстрагированной из образцов крови двух пациентов, несущих патогенные варианты, выявленные в предыдущем исследовании (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Эта валидация сравнит цифровую ПЦР с методом ПЦР-ПДРФ для количественного определения гетероплазмии и оценит надежность и воспроизводимость техники. После достижения валидации цифровая ПЦР будет протестирована на ДНК, экстрагированной из микродиссецированных мышечных волокон тех же пациентов, для оценки ее осуществимости на уровне отдельных волокон, с сравнением с результатами ПЦР-ПДРФ. Если осуществимость на уровне отдельных волокон будет подтверждена, метод затем будет протестирован на четырех новых пациентах из Референс-центра по митохондриальным заболеваниям, у которых выявлены варианты с неопределенным значением и для которых доступны мышечные биоптаты с COX-отрицательными волокнами. Будут собраны дополнительные образцы (кровь, моча и буккальные мазки) для оценки уровней гетероплазмии в различных тканях. Если метод будет валидирован, эта техника может быть применена к большему числу пациентов и интегрирована в диагностическую стратегию для митохондриальных заболеваний.

Более того, цифровая ПЦР также может использоваться для количественного определения числа копий мтДНК, важного биомаркера для мониторинга пациентов с МЗ. С этой целью мтДНК разделяется на тысячи нанолунок, и абсолютное количественное определение получается путем подсчета флуоресцентных сигналов, излучаемых положительными партициями, с использованием зонда ядерной ДНК в качестве внутреннего контроля. Эта валидация будет проведена с использованием тех же образцов крови и мышечных волокон, путем сравнения результатов цифровой ПЦР с результатами, полученными с помощью референсного метода, количественной ПЦР (qPCR).

Основная цель этого исследования — сократить диагностические одиссеи путем упрощения существующих методов. Кроме того, применение цифровой ПЦР для количественного определения числа копий мтДНК может открыть новые перспективы, особенно в качестве биомаркера для мониторинга пациентов и разработки клинических испытаний.