Uuden tekniikan kehittäminen mitokondriaalisen DNA:n kvantifiointiin yksittäisissä lihassoluissa (DIGITAL_MITO)

Mitokondriosairaudet (MD) ovat yleisimmät aineenvaihduntasairaudet. Niiden suuren kliinisen ja geneettisen heterogeenisyyden vuoksi niiden diagnoosi perustuu yksinomaan patogeenisten varianttien tunnistamiseen tumageeneistä tai mitokondriaalisesta DNA:sta (mtDNA). Toistaiseksi kuitenkin 50% sairastuneista potilaista jää ilman lopullista diagnoosia. Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on parantanut diagnoosien määrää, mutta monet tunnistetut variantit pysyvät epävarmassa merkityksessä (VUS), mikä estää lopullisen diagnoosin asettamisen. Näiden vasta löydettyjen harvinaisten varianttien kliininen tulkinta edustaa siten merkittävää haastetta.

Mitokondriosairauksien yhteydessä yksi tärkeimmistä mtDNA-variantin patogeenisuuden kriteereistä on hyvä korrelaatio heteroplasmiatason ja kudos- tai solutasoisen vaikutuksen välillä. Heteroplasmia viittaa mutatoituneiden ja ei-mutatoituneiden mtDNA-molekyylien rinnakkaiseloonsa saman solun tai kudoksen sisällä. Patogeeniset mtDNA-variantit ovat useimmiten heteroplasmisia, ja eniten vaikutetuissa kudoksissa on suurempi osuus mutatoitunutta mtDNA:ta. MD-potilaiden lihasbiopsioissa lihassäikeet voivat osoittaa sytohromi c-oksidaasin (COX) entsymaattista puutetta (COX-negatiiviset säikeet), mikä heijastaa mitokondriaalisen hengitysketjun (MRC) toimintahäiriötä. Yksittäissäikeanalyysi mahdollistaa lihassäikeiden eristämisen LASER-mikrodisektiolla ja variantin heteroplasmiatason määrittämisen niissä. Korkean heteroplasmiatason läsnäolo COX-negatiivisissa säikeissä, toisin kuin puutteettomissa säikeissä (COX-positiiviset säikeet), on vahva näyttö variantin patogeenisuuden puolesta. Aiemmissa hankkeissa testasimme kahta variantin kvantifiointitekniikkaa (PCR-RFLP ja NGS), mutta nämä menetelmät ovat edelleen liian työläitä tai kalliita ja siksi vaikeita ylläpitää rutiinikäytännössä.

Tämä pilottitutkimus tähtää uuden menetelmän kehittämiseen heteroplasmiatasojen kvantifiointiin digitaalisen PCR:n avulla. Nopeampi ja edullisempi tämä lähestymistapa voisi yksinkertaistaa teknistä toteutusta ja vähentää analyysikustannuksia, helpottaen siten sen integrointia kliiniseen käytäntöön. Aluksi toteutettavuustutkimus aloitetaan digitaalisen PCR:n validoinnilla kahden potilaan verinäytteistä eristetylle DNA:lle, jotka kantavat aiemmassa tutkimuksessa tunnistettuja patogeenisia variantteja (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Tämä validointi vertaa digitaalista PCR:ää PCR-RFLP-menetelmään heteroplasmian kvantifioinnissa ja arvioi tekniikan luotettavuutta ja toistettavuutta. Kun validointi on saavutettu, digitaalista PCR:ää testataan samoista potilaista mikrodisektioiduista lihassäikeistä eristetylle DNA:lle arvioimaan sen toteutettavuutta yksittäissäiketasolla, vertaamalla tuloksia PCR-RFLP-tuloksiin. Jos toteutettavuus yksittäissäiketasolla vahvistetaan, menetelmää testataan sitten neljällä uudella potilaalla Mitokondriosairauksien viitekeskuksesta, joilla on tunnistettu epävarman merkityksen variantteja ja joilla on saatavilla lihasbiopsioita COX-negatiivisilla säikeillä. Lisänäytteitä (veri, virtsa ja poskieristys) kerätään arvioimaan heteroplasmiatasoja eri kudoksissa. Jos validoidaan, tätä tekniikkaa voitaisiin soveltaa suuremmalle potilasmäärälle ja integroida mitokondriosairauksien diagnoosistrategiaan.

Lisäksi digitaalista PCR:ää voitaisiin käyttää myös mtDNA-kopioluvun kvantifiointiin, joka on olennainen biomarkkeri MD-potilaiden seurannassa. Tätä varten mtDNA jaetaan tuhansiin nanokuoppiin, ja absoluuttinen kvantifiointi saadaan laskemalla positiivisista osioista lähetetyt fluoresoivat signaalit, kun tuma-DNA-anturia käytetään sisäisenä kontrollina. Tämä validointi suoritetaan samoilla verinäytteillä ja lihassäikeillä vertaamalla digitaalisen PCR:n tuloksia vertailumenetelmän, kvantitatiivisen PCR:n (qPCR), tuloksiin.

Tämän tutkimuksen ensisijainen tavoite on vähentää diagnoosiodysseia yksinkertaistamalla olemassa olevia menetelmiä. Lisäksi digitaalisen PCR:n soveltaminen mtDNA-kopioluvun kvantifiointiin voisi tarjota uusia näkökulmia, erityisesti biomarkkerina potilaiden seurantaan ja kliinisten kokeiden kehittämiseen.