Udvikling af en ny teknik til kvantificering af mitokondriel DNA i enkelte muskelfibre (DIGITAL_MITO)

Mitokondrielle sygdomme (MD) er de mest almindelige metaboliske forstyrrelser. På grund af deres store kliniske og genetiske heterogenitet afhænger deres diagnose udelukkende af identifikation af patogene varianter i nukleære gener eller i mitokondrie-DNA (mtDNA). Men indtil videre forbliver 50% af de berørte patienter uden en endelig diagnose. Indførelsen af next-generation sequencing (NGS) har forbedret diagnostisk udbytte, men mange identificerede varianter forbliver af usikker betydning (VUS), hvilket forhindrer en endelig diagnose. Den kliniske fortolkning af disse nyligt identificerede sjældne varianter udgør derfor en stor udfordring.

I forbindelse med MD er et af de største kriterier for mtDNA-variantpatogenicitet en god korrelation mellem heteroplasmieniveau og væv- eller celleinvolvering. Heteroplasmi refererer til sameksistensen, inden for den samme celle eller det samme væv, af muterede og ikke-muterede mtDNA-molekyler. Patogene mtDNA-varianter er oftest heteroplasmatiske, hvor de mest berørte væv indeholder en højere andel af muteret mtDNA. I muskelbiopsier fra patienter med MD kan muskelfibre vise en cytochrom c-oxidase (COX) enzymatisk mangel (COX-negative fibre), hvilket afspejler dysfunktion i den mitokondrielle respiratoriske kæde (MRC). Enkeltfiberanalyse gør det muligt at isolere muskelfibre ved LASER-mikrodissektion og at kvantificere heteroplasmieniveauet for en variant inden i dem. Tilstedeværelsen af et højt heteroplasmieniveau i COX-negative fibre, i modsætning til fibre uden mangel (COX-positive fibre), er stærkt bevis for variantens patogenicitet. I tidligere projekter testede vi to variantkvantificeringsteknikker (PCR-RFLP og NGS), men disse metoder forbliver for arbejdskrævende eller dyre og er derfor svære at opretholde i rutinepraksis.

Dette pilotstudie har til formål at udvikle en ny metode til kvantificering af heteroplasmieniveauer ved hjælp af digital PCR. Hurtigere og billigere kan denne tilgang forenkle teknisk implementering og reducere analyseomkostninger, hvilket letter dens integration i klinisk praksis. Indledningsvis vil en gennemførlighedsundersøgelse begynde med validering af digital PCR på DNA ekstraheret fra blodprøver fra to patienter, der bærer patogene varianter identificeret i en tidligere undersøgelse (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Denne validering vil sammenligne digital PCR med PCR-RFLP-metoden til heteroplasmikvantificering og vurdere teknikens pålidelighed og reproducerbarhed. Når validering er opnået, vil digital PCR blive testet på DNA ekstraheret fra mikrodissocerede muskelfibre fra de samme patienter for at vurdere dens gennemførlighed på enkeltfiberniveau, med sammenligning med PCR-RFLP-resultater. Hvis gennemførlighed på enkeltfiberniveau bekræftes, vil metoden derefter blive testet på fire nye patienter fra Mitokondrielle Sygdomme Referencecenter, hvor varianter af usikker betydning er identificeret, og hvor muskelbiopsier med COX-negative fibre er tilgængelige. Yderligere prøver (blod, urin og mundskrab) vil blive indsamlet for at vurdere heteroplasmieniveauer på tværs af forskellige væv. Hvis valideret, kunne denne teknik anvendes på et større antal patienter og integreres i diagnostisk strategi for mitokondrielle sygdomme.

Desuden kunne digital PCR også bruges til at kvantificere mtDNA-kopital, en essentiel biomarkør til overvågning af patienter med MD. Til dette formål partitioneres mtDNA i tusindvis af nanobrønde, og absolut kvantificering opnås ved at tælle fluorescerende signaler udsendt af positive partitioner, med en nukleær DNA-sonde som intern kontrol. Denne validering vil blive udført ved hjælp af de samme blodprøver og muskelfibre ved at sammenligne digital PCR-resultater med dem opnået ved brug af referencemetoden, kvantitativ PCR (qPCR).

Det primære mål med denne undersøgelse er at reducere diagnostiske odysséer ved at forenkle eksisterende metoder. Derudover kunne anvendelsen af digital PCR til at kvantificere mtDNA-kopital tilbyde nye perspektiver, især som biomarkør til patientovervågning og udvikling af kliniske forsøg.