Développement d'une nouvelle technique de quantification de l'ADN mitochondrial dans des fibres musculaires uniques (DIGITAL_MITO)

Les maladies mitochondriales (MM) sont les troubles métaboliques les plus fréquents. En raison de leur grande hétérogénéité clinique et génétique, leur diagnostic repose exclusivement sur l'identification de variants pathogènes dans des gènes nucléaires ou dans l'ADN mitochondrial (ADNmt). Cependant, à ce jour, 50 % des patients atteints restent sans diagnostic définitif. L'avènement du séquençage de nouvelle génération (NGS) a amélioré le rendement diagnostique, mais de nombreux variants identifiés restent de signification incertaine (VUS), empêchant un diagnostic définitif. L'interprétation clinique de ces nouveaux variants rares représente donc un défi majeur.

Dans le contexte des MM, l'un des principaux critères de pathogénicité des variants de l'ADNmt est une bonne corrélation entre le niveau d'hétéroplasmie et l'atteinte tissulaire ou cellulaire. L'hétéroplasmie désigne la coexistence, au sein d'une même cellule ou d'un même tissu, de molécules d'ADNmt mutées et non mutées. Les variants pathogènes de l'ADNmt sont le plus souvent hétéroplasmiques, les tissus les plus atteints présentant une proportion plus élevée d'ADNmt muté. Dans les biopsies musculaires de patients atteints de MM, les fibres musculaires peuvent présenter un déficit enzymatique en cytochrome c oxydase (COX) (fibres COX-négatives), reflétant un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC). L'analyse de fibre unique permet d'isoler des fibres musculaires par microdissection LASER et de quantifier le niveau d'hétéroplasmie d'un variant au sein de celles-ci. La présence d'un niveau élevé d'hétéroplasmie dans les fibres COX-négatives, contrairement aux fibres sans déficit (fibres COX-positives), est un argument fort en faveur de la pathogénicité du variant. Dans des projets précédents, nous avons testé deux techniques de quantification des variants (PCR-RFLP et NGS), mais ces méthodes restent trop laborieuses ou coûteuses et sont donc difficiles à maintenir en pratique courante.

Cette étude pilote vise à développer une nouvelle méthode de quantification des niveaux d'hétéroplasmie par PCR digitale. Plus rapide et moins coûteuse, cette approche pourrait simplifier la mise en œuvre technique et réduire les coûts d'analyse, facilitant ainsi son intégration dans la pratique clinique. Dans un premier temps, une étude de faisabilité débutera par la validation de la PCR digitale sur l'ADN extrait d'échantillons sanguins de deux patients porteurs de variants pathogènes identifiés dans une étude précédente (AOI 2017 IDRCB : 2017-A00688-45). Cette validation comparera la PCR digitale à la méthode PCR-RFLP pour la quantification de l'hétéroplasmie et évaluera la fiabilité et la reproductibilité de la technique. Une fois la validation réalisée, la PCR digitale sera testée sur l'ADN extrait de fibres musculaires microdisséquées des mêmes patients pour évaluer sa faisabilité au niveau de la fibre unique, avec une comparaison aux résultats de la PCR-RFLP. Si la faisabilité au niveau de la fibre unique est confirmée, la méthode sera ensuite testée chez quatre nouveaux patients du Centre de Référence des Maladies Mitochondriales, chez lesquels des variants de signification incertaine ont été identifiés et pour lesquels des biopsies musculaires avec des fibres COX-négatives sont disponibles. Des échantillons supplémentaires (sang, urine et frottis buccal) seront prélevés pour évaluer les niveaux d'hétéroplasmie dans différents tissus. Si elle est validée, cette technique pourrait être appliquée à un plus grand nombre de patients et intégrée à la stratégie diagnostique des maladies mitochondriales.

Par ailleurs, la PCR digitale pourrait également être utilisée pour quantifier le nombre de copies d'ADNmt, un biomarqueur essentiel pour le suivi des patients atteints de MM. À cette fin, l'ADNmt est partitionné en milliers de nanopuits, et une quantification absolue est obtenue en comptant les signaux fluorescents émis par les partitions positives, avec une sonde d'ADN nucléaire servant de contrôle interne. Cette validation sera réalisée en utilisant les mêmes échantillons sanguins et fibres musculaires, en comparant les résultats de la PCR digitale à ceux obtenus par la méthode de référence, la PCR quantitative (qPCR).

L'objectif principal de cette étude est de réduire les errances diagnostiques en simplifiant les méthodes existantes. De plus, l'application de la PCR digitale pour quantifier le nombre de copies d'ADNmt pourrait offrir de nouvelles perspectives, notamment comme biomarqueur pour le suivi des patients et le développement d'essais cliniques.