Desarrollo de una nueva técnica para cuantificar el ADN mitocondrial en fibras musculares individuales (DIGITAL_MITO)

Las enfermedades mitocondriales (EM) son los trastornos metabólicos más comunes. Debido a su gran heterogeneidad clínica y genética, su diagnóstico se basa exclusivamente en la identificación de variantes patogénicas en genes nucleares o en el ADN mitocondrial (ADNmt). Sin embargo, hasta la fecha, el 50% de los pacientes afectados permanecen sin un diagnóstico definitivo. La llegada de la secuenciación de próxima generación (NGS) ha mejorado el rendimiento diagnóstico, pero muchas variantes identificadas siguen siendo de significado incierto (VUS), impidiendo un diagnóstico definitivo. La interpretación clínica de estas variantes raras recién identificadas representa, por tanto, un gran desafío.

En el contexto de las EM, uno de los principales criterios de patogenicidad de las variantes de ADNmt es una buena correlación entre el nivel de heteroplasmia y la afectación tisular o celular. La heteroplasmia se refiere a la coexistencia, dentro de la misma célula o tejido, de moléculas de ADNmt mutadas y no mutadas. Las variantes patogénicas de ADNmt son con mayor frecuencia heteroplásmicas, siendo los tejidos más afectados los que albergan una mayor proporción de ADNmt mutado. En biopsias musculares de pacientes con EM, las fibras musculares pueden mostrar una deficiencia enzimática de citocromo c oxidasa (COX) (fibras COX-negativas), lo que refleja una disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM). El análisis de fibra única permite aislar fibras musculares mediante microdisección con LÁSER y cuantificar el nivel de heteroplasmia de una variante dentro de ellas. La presencia de un alto nivel de heteroplasmia en fibras COX-negativas, en contraste con fibras sin deficiencia (fibras COX-positivas), es una fuerte evidencia que respalda la patogenicidad de la variante. En proyectos anteriores, probamos dos técnicas de cuantificación de variantes (PCR-RFLP y NGS), pero estos métodos siguen siendo demasiado laboriosos o costosos y, por lo tanto, difíciles de mantener en la práctica rutinaria.

Este estudio piloto tiene como objetivo desarrollar un nuevo método para cuantificar niveles de heteroplasmia utilizando PCR digital. Más rápida y menos costosa, esta aproximación podría simplificar la implementación técnica y reducir los costes de análisis, facilitando así su integración en la práctica clínica. Inicialmente, un estudio de viabilidad comenzará con la validación de la PCR digital en ADN extraído de muestras de sangre de dos pacientes portadores de variantes patogénicas identificadas en un estudio previo (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Esta validación comparará la PCR digital con el método PCR-RFLP para la cuantificación de heteroplasmia y evaluará la fiabilidad y reproducibilidad de la técnica. Una vez lograda la validación, se probará la PCR digital en ADN extraído de fibras musculares microdiseccionadas de los mismos pacientes para evaluar su viabilidad a nivel de fibra única, comparando con los resultados de PCR-RFLP. Si se confirma la viabilidad a nivel de fibra única, el método se probará luego en cuatro nuevos pacientes del Centro de Referencia de Enfermedades Mitocondriales, en los que se han identificado variantes de significado incierto y para los que se dispone de biopsias musculares con fibras COX-negativas. Se recogerán muestras adicionales (sangre, orina y frotis bucales) para evaluar los niveles de heteroplasmia en diferentes tejidos. Si se valida, esta técnica podría aplicarse a un mayor número de pacientes e integrarse en la estrategia diagnóstica de las enfermedades mitocondriales.

Además, la PCR digital también podría utilizarse para cuantificar el número de copias de ADNmt, un biomarcador esencial para el seguimiento de pacientes con EM. Para ello, el ADNmt se particiona en miles de nanopoços, y se obtiene una cuantificación absoluta contando las señales fluorescentes emitidas por las particiones positivas, utilizando una sonda de ADN nuclear como control interno. Esta validación se realizará utilizando las mismas muestras de sangre y fibras musculares, comparando los resultados de la PCR digital con los obtenidos mediante el método de referencia, la PCR cuantitativa (qPCR).

El objetivo principal de este estudio es reducir las odiseas diagnósticas simplificando los métodos existentes. Además, la aplicación de la PCR digital para cuantificar el número de copias de ADNmt podría ofrecer nuevas perspectivas, particularmente como biomarcador para el seguimiento de pacientes y el desarrollo de ensayos clínicos.