Utvikling av en ny teknikk for kvantifisering av mitokondrielt DNA i enkelte muskelfibre (DIGITAL_MITO)

Mitokondriesykdommer (MDs) er de vanligste metabolske lidelsene. På grunn av deres store kliniske og genetiske heterogenitet, er diagnosen deres utelukkende avhengig av identifisering av patogene varianter i kjernegener eller i mitokondrielt DNA (mtDNA). Men til dags dato har 50 % av berørte pasienter fortsatt ingen endelig diagnose. Introduksjonen av neste-generasjons sekvensering (NGS) har forbedret diagnostisk utbytte, men mange identifiserte varianter forblir av usikker betydning (VUS), noe som forhindrer en endelig diagnose. Den kliniske tolkningen av disse nylig identifiserte sjeldne variantene representerer derfor en stor utfordring.

I sammenheng med MDs, er et av hovedkriteriene for mtDNA-variantens patogenitet en god korrelasjon mellom heteroplasmikul og vevs- eller cellulær involvering. Heteroplasmikul refererer til sameksistensen, i samme celle eller vev, av muterte og ikke-muterte mtDNA-molekyler. Patogene mtDNA-varianter er oftest heteroplasmatiske, der de mest berørte vevene har en høyere andel mutert mtDNA. I muskelbiopsier fra pasienter med MDs, kan muskelfibre vise en cytochrom c oksidase (COX) enzymatisk mangel (COX-negative fibre), som reflekterer dysfunksjon i den mitokondrielle respirasjonskjeden (MRC). Enkeltfiberanalyse gjør det mulig å isolere muskelfibre ved LASER-mikrodisseksjon og å kvantifisere heteroplasmikul av en variant innenfor dem. Tilstedeværelsen av et høyt heteroplasmikul i COX-negative fibre, i kontrast til fibre uten mangel (COX-positive fibre), er sterkt bevis som støtter variantens patogenitet. I tidligere prosjekter testet vi to variantkvantifiseringsteknikker (PCR-RFLP og NGS), men disse metodene forblir for arbeidskrevende eller kostbare og er derfor vanskelige å opprettholde i rutinemessig praksis.

Denne pilotstudien har som mål å utvikle en ny metode for å kvantifisere heteroplasmikul ved bruk av digital PCR. Raskere og billigere, kan denne tilnærmingen forenkle teknisk implementering og redusere analysekostnader, og dermed lette dens integrering i klinisk praksis. Innledningsvis vil en gjennomførbarhetsstudie starte med validering av digital PCR på DNA ekstrahert fra blodprøver fra to pasienter som bærer patogene varianter identifisert i en tidligere studie (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Denne valideringen vil sammenligne digital PCR med PCR-RFLP-metoden for heteroplasmikul-kvantifisering og vurdere teknikkenes pålitelighet og reproduserbarhet. Når validering er oppnådd, vil digital PCR bli testet på DNA ekstrahert fra mikrodissikerte muskelfibre fra de samme pasientene for å vurdere dens gjennomførbarhet på enkeltfibernivå, med sammenligning mot PCR-RFLP-resultater. Hvis gjennomførbarhet på enkeltfibernivå bekreftes, vil metoden deretter bli testet på fire nye pasienter fra Mitokondriesykdommer Referansesenter, hvor varianter av usikker betydning er identifisert og hvor muskelbiopsier med COX-negative fibre er tilgjengelige. Ytterligere prøver (blod, urin og kinnskrap) vil bli samlet for å vurdere heteroplasmikul på tvers av forskjellige vev. Hvis validert, kan denne teknikken bli anvendt på et større antall pasienter og integrert i diagnostisk strategi for mitokondriesykdommer.

Videre kan digital PCR også brukes til å kvantifisere mtDNA-kopital, en essensiell biomarkør for overvåking av pasienter med MDs. Til dette formålet blir mtDNA partisjonert i tusenvis av nanobrønner, og absolutt kvantifisering oppnås ved å telle fluorescerende signaler utsendt av positive partisjoner, med en kjerne-DNA-sonde som fungerer som intern kontroll. Denne valideringen vil bli utført ved bruk av de samme blodprøvene og muskelfibrene, ved å sammenligne digitale PCR-resultater med de oppnådd ved bruk av referansemetoden, kvantitativ PCR (qPCR).

Den primære målet med denne studien er å redusere diagnostiske odysséer ved å forenkle eksisterende metoder. I tillegg kan anvendelsen av digital PCR for å kvantifisere mtDNA-kopital tilby nye perspektiver, spesielt som en biomarkør for pasientoppfølging og utvikling av kliniske forsøk.