单肌纤维线粒体DNA定量新技术的开发 (DIGITAL_MITO)
开发一种量化单肌纤维中线粒体DNA的新技术，作为解释线粒体疾病中意义未明变异的工具
线粒体疾病（MDs）是最常见的代谢性疾病。由于其临床和遗传异质性极大，其诊断完全依赖于核基因或线粒体DNA（mtDNA）中致病性变异的识别。然而，迄今为止，50%的受影响患者仍未获得明确诊断。下一代测序（NGS）的出现提高了诊断率，但许多已识别的变异仍具有不确定的临床意义（VUS），阻碍了明确诊断。因此，对这些新发现的罕见变异进行临床解释是一个重大挑战。
在线粒体疾病的背景下，mtDNA变异致病性的主要标准之一是异质性水平与组织或细胞受累之间的良好相关性。异质性是指在同一个细胞或组织内，突变和非突变的mtDNA分子共存。致病性mtDNA变异通常是异质性的，受影响最严重的组织含有更高比例的突变mtDNA。在线粒体疾病患者的肌肉活检中，肌纤维可能显示细胞色素c氧化酶（COX）酶活性缺乏（COX阴性纤维），反映了线粒体呼吸链（MRC）的功能障碍。单纤维分析通过激光显微切割分离肌纤维，并量化其中变异的异质性水平。与没有缺陷的纤维（COX阳性纤维）相比，COX阴性纤维中存在高异质性水平是支持变异致病性的有力证据。在之前的项目中，我们测试了两种变异量化技术（PCR-RFLP和NGS），但这些方法仍然过于费力或昂贵，因此难以在常规实践中维持。
这项初步研究旨在开发一种使用数字PCR量化异质性水平的新方法。这种方法更快且成本更低，可以简化技术实施并降低分析成本，从而促进其在临床实践中的整合。最初，可行性研究将从验证数字PCR开始，使用从两名携带先前研究中识别出的致病性变异患者的血液样本中提取的DNA进行验证（AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45）。该验证将比较数字PCR与PCR-RFLP方法在异质性量化方面的表现，并评估该技术的可靠性和可重复性。一旦验证成功，数字PCR将在从相同患者的显微切割肌纤维中提取的DNA上进行测试，以评估其在单纤维水平上的可行性，并与PCR-RFLP结果进行比较。如果单纤维水平的可行性得到确认，该方法将在来自线粒体疾病参考中心的四名新患者中进行测试，这些患者已识别出具有不确定临床意义的变异，并且有可用的带有COX阴性纤维的肌肉活检样本。将收集额外的样本（血液、尿液和口腔拭子）以评估不同组织中的异质性水平。如果验证成功，该技术可以应用于更多患者，并整合到线粒体疾病的诊断策略中。
此外，数字PCR还可用于量化mtDNA拷贝数，这是监测线粒体疾病患者的重要生物标志物。为此，mtDNA被分配到数千个纳米孔中，通过计数阳性孔发出的荧光信号进行绝对量化，并使用核DNA探针作为内参。该验证将使用相同的血液样本和肌纤维进行，通过比较数字PCR结果与参考方法定量PCR（qPCR）获得的结果。
本研究的主要目标是通过简化现有方法来减少诊断过程。此外，应用数字PCR量化mtDNA拷贝数可能提供新的视角，特别是作为患者监测和临床试验开发的生物标志物。
研究概览
研究类型
注册 (估计的)
阶段
- 不适用
联系人和位置
学习联系方式
- 姓名：Cécile Rouzier, MD-PhD
- 电话号码：+33 (0)4 92 03 62 43
- 邮箱：rouzier.c@chu-nice.fr
学习地点
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Bron、法国、69500
- Groupement Hospitalier Est Hospices civils de Lyon - Service de génétique médicale
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接触：
- Pauline Monin, Ph
- 电话号码：+33 (0)4 27 85 55 73
- 邮箱：pauline.monin@chu-lyon.fr
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Montpellier、法国、34295
- Hôpital Gui de Chauliac - Service de Neurologie
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接触：
- Cecilia Marelli, Ph
- 电话号码：+33 (0)4 67 33 60 29
- 邮箱：c-marelli@chu-montpellier.fr
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Provence-Alpes-Côte d'Azur Region
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Nice、Provence-Alpes-Côte d'Azur Region、法国、06202
- CHU de Nice - Service de Génétique Médicale
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接触：
- Cécile Rouzier, MD-PhD
- 电话号码：+33 (0)4 92 03 62 43
- 邮箱：rouzier.c@chu-nice.fr
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接触：
- Claire Hoarau
- 电话号码：+33 (6)4 92 03 94 05
- 邮箱：hoarau.c@chu-nice.fr
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参与标准
资格标准
适合学习的年龄
- 孩子
- 成人
- 年长者
接受健康志愿者
描述
纳入标准：
- 成年或未成年患者，散发性或孤立性病例
- 签署知情同意书；对于未成年患者：需父母双方或法定监护人签字，除非在合理期限内无法获得其中一方的同意
- 加入社会保障体系
临床医生在线粒体疾病参考中心评估疑似线粒体疾病，至少符合以下一项：
- 临床表现提示线粒体疾病（症状异常组合、特定综合征如MELAS、肌无力、眼睑下垂等）和/或
- 代谢检查提示呼吸链受累和/或
- 肌肉活检发现一个或多个呼吸链复合物缺陷
- 既往已识别出意义未明的线粒体DNA变异（VUS）的患者
- 肌肉活检组织学分析显示至少5个COX阴性纤维
- 可获得肌肉活检样本，并能从病理实验室调取切片
排除标准：
- 拒绝签署研究同意书
- 因非研究目的入住医疗或社会机构的个体
- 受法律监护的成年人（监护权、保护性监管）
- 孕妇或哺乳期妇女
学习计划
研究是如何设计的？
设计细节
- 主要用途：诊断
- 分配：不适用
- 介入模型：单组作业
- 屏蔽：无（打开标签）
武器和干预
参与者组/臂 |
干预/治疗 |
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实验性的：线粒体疾病组
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干预措施包括使用数字PCR（dPCR）来定量线粒体DNA（mtDNA）异质性水平和mtDNA拷贝数。dPCR将在从血液、尿液和口腔（唾液）样本中提取的DNA上进行，同时也对从肌肉活检中获得的激光显微切割单肌纤维样本进行检测。 该方法将通过与传统参考技术（异质性检测采用PCR-RFLP，mtDNA拷贝数检测采用定量PCR）进行比较来验证其准确性和可重复性。随后，dPCR将应用于携带意义未明变异的患者，以评估异质性水平与组织受累之间的相关性，从而支持变异致病性评估。 该干预措施不涉及任何额外的侵入性操作，因为所有样本均作为常规临床护理的一部分进行采集。 |
研究衡量的是什么？
主要结果指标
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
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验证一种新的数字PCR技术，用于量化单个肌纤维中变异体的异质性水平，以提高诊断检出率。
大体时间：入选访视
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数字PCR与PCR-RFLP在量化两名携带已知致病性变异患者异质性水平方面结果的一致性。
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入选访视
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次要结果测量
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
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验证一种用于量化线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的新型数字PCR技术
大体时间：入选访视
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数字PCR与qPCR在定量线粒体DNA拷贝数方面结果的一致性，通过Mann-Whitney检验评估，p值>0.05，表明两种技术之间无差异
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入选访视
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合作者和调查者
研究记录日期
研究主要日期
学习开始 (估计的)
初级完成 (估计的)
研究完成 (估计的)
研究注册日期
首次提交
首先提交符合 QC 标准的
首次发布 (实际的)
研究记录更新
最后更新发布 (实际的)
上次提交的符合 QC 标准的更新
最后验证
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