Ontwikkeling van een nieuwe techniek voor het kwantificeren van mitochondriaal DNA in individuele spiervezels (DIGITAL_MITO)

Mitochondriale ziekten (MZ) zijn de meest voorkomende stofwisselingsziekten. Vanwege hun grote klinische en genetische heterogeniteit is de diagnose uitsluitend gebaseerd op de identificatie van pathogene varianten in nucleaire genen of in mitochondriaal DNA (mtDNA). Tot op heden blijft echter 50% van de getroffen patiënten zonder definitieve diagnose. De komst van next-generation sequencing (NGS) heeft de diagnostische opbrengst verbeterd, maar veel geïdentificeerde varianten blijven van onzekere betekenis (VUS), wat een definitieve diagnose verhindert. De klinische interpretatie van deze nieuw geïdentificeerde zeldzame varianten vormt daarom een grote uitdaging.

In de context van MZ is een van de belangrijkste criteria voor de pathogeniteit van mtDNA-varianten een goede correlatie tussen heteroplasmieniveau en weefsel- of cellulaire betrokkenheid. Heteroplasmie verwijst naar de gelijktijdige aanwezigheid, binnen dezelfde cel of hetzelfde weefsel, van gemuteerde en niet-gemuteerde mtDNA-moleculen. Pathogene mtDNA-varianten zijn meestal heteroplasmatisch, waarbij de meest aangetaste weefsels een hoger aandeel gemuteerd mtDNA bevatten. In spierbiopten van patiënten met MZ kunnen spiervezels een cytochroom c oxidase (COX) enzymatisch tekort vertonen (COX-negatieve vezels), wat een disfunctie van de mitochondriële ademhalingsketen (MRC) weerspiegelt. Analyse van enkele vezels maakt het mogelijk om spiervezels te isoleren door LASER-microdissectie en het heteroplasmieniveau van een variant daarin te kwantificeren. De aanwezigheid van een hoog heteroplasmieniveau in COX-negatieve vezels, in tegenstelling tot vezels zonder tekort (COX-positieve vezels), is sterk bewijs dat de pathogeniteit van de variant ondersteunt. In eerdere projecten hebben we twee variantkwantificatietechnieken (PCR-RFLP en NGS) getest, maar deze methoden blijven te arbeidsintensief of kostbaar en zijn daarom moeilijk te handhaven in de dagelijkse praktijk.

Deze pilotstudie heeft als doel een nieuwe methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van heteroplasmieniveaus met behulp van digitale PCR. Sneller en goedkoper kan deze aanpak de technische implementatie vereenvoudigen en de analysiekosten verlagen, waardoor de integratie in de klinische praktijk wordt vergemakkelijkt. In eerste instantie zal een haalbaarheidsstudie beginnen met validatie van digitale PCR op DNA geëxtraheerd uit bloedmonsters van twee patiënten met pathogene varianten geïdentificeerd in een eerdere studie (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Deze validatie zal digitale PCR vergelijken met de PCR-RFLP-methode voor heteroplasmiekwantificatie en de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de techniek beoordelen. Zodra de validatie is voltooid, zal digitale PCR worden getest op DNA geëxtraheerd uit microgedissecteerde spiervezels van dezelfde patiënten om de haalbaarheid op het niveau van enkele vezels te evalueren, met vergelijking met PCR-RFLP-resultaten. Als de haalbaarheid op het niveau van enkele vezels wordt bevestigd, zal de methode vervolgens worden getest bij vier nieuwe patiënten van het Referentiecentrum voor Mitochondriale Ziekten, bij wie varianten van onzekere betekenis zijn geïdentificeerd en voor wie spierbiopten met COX-negatieve vezels beschikbaar zijn. Aanvullende monsters (bloed, urine en wangswabs) worden verzameld om heteroplasmieniveaus in verschillende weefsels te beoordelen. Indien gevalideerd, kan deze techniek worden toegepast op een groter aantal patiënten en worden geïntegreerd in de diagnostische strategie voor mitochondriale ziekten.

Bovendien kan digitale PCR ook worden gebruikt om het mtDNA-kopieaantal te kwantificeren, een essentiële biomarker voor het monitoren van patiënten met MZ. Hiertoe wordt mtDNA verdeeld in duizenden nanowellen, en absolute kwantificatie wordt verkregen door het tellen van fluorescente signalen uitgezonden door positieve partities, waarbij een nucleair DNA-probe dient als interne controle. Deze validatie wordt uitgevoerd met dezelfde bloedmonsters en spiervezels, door de resultaten van digitale PCR te vergelijken met die verkregen met de referentiemethode, kwantitatieve PCR (qPCR).

Het primaire doel van deze studie is om diagnostische odysseeën te verminderen door bestaande methoden te vereenvoudigen. Bovendien kan de toepassing van digitale PCR om het mtDNA-kopieaantal te kwantificeren nieuwe perspectieven bieden, met name als biomarker voor patiëntmonitoring en de ontwikkeling van klinische onderzoeken.