Vývoj nové techniky pro kvantifikaci mitochondriální DNA v jednotlivých svalových vláknech (DIGITAL_MITO)

Mitochondriální onemocnění (MD) jsou nejčastější metabolické poruchy. Kvůli jejich velké klinické a genetické heterogenitě se jejich diagnostika opírá výhradně o identifikaci patogenních variant v jaderných genech nebo v mitochondriální DNA (mtDNA). Nicméně až dosud zůstává 50 % postižených pacientů bez definitivní diagnózy. Nástup sekvenování nové generace (NGS) zvýšil diagnostickou výtěžnost, ale mnoho identifikovaných variant zůstává s nejistým významem (VUS), což brání definitivní diagnóze. Klinická interpretace těchto nově identifikovaných vzácných variant tedy představuje hlavní výzvu.

V kontextu MD je jedním z hlavních kritérií patogenity variant mtDNA dobrá korelace mezi úrovní heteroplasmie a postižením tkáně nebo buněk. Heteroplasmie označuje souběžnou existenci mutovaných a nemutovaných molekul mtDNA ve stejné buňce nebo tkáni. Patogenní varianty mtDNA jsou nejčastěji heteroplasmické, přičemž nejvíce postižené tkáně obsahují vyšší podíl mutované mtDNA. Ve svalových biopsiích pacientů s MD mohou svalová vlákna vykazovat enzymatický deficit cytochrom c oxidázy (COX) (COX-negativní vlákna), což odráží dysfunkci mitochondriálního respiračního řetězce (MRC). Analýza jednotlivých vláken umožňuje izolovat svalová vlákna pomocí LASERové mikrodisekce a kvantifikovat v nich úroveň heteroplasmie varianty. Přítomnost vysoké úrovně heteroplasmie v COX-negativních vláknech, na rozdíl od vláken bez deficitu (COX-pozitivní vlákna), je silným důkazem podporujícím patogenitu varianty. V předchozích projektech jsme testovali dvě techniky kvantifikace variant (PCR-RFLP a NGS), ale tyto metody zůstávají příliš pracné nebo nákladné, a proto je obtížné je udržovat v rutinní praxi.

Tato pilotní studie si klade za cíl vyvinout novou metodu pro kvantifikaci úrovní heteroplasmie pomocí digitální PCR. Rychlejší a méně nákladný přístup by mohl zjednodušit technickou implementaci a snížit náklady na analýzu, což by usnadnilo jeho integraci do klinické praxe. Zpočátku začne studie proveditelnosti validací digitální PCR na DNA extrahované z krevních vzorků dvou pacientů nesoucích patogenní varianty identifikované v předchozí studii (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Tato validace porovná digitální PCR s metodou PCR-RFLP pro kvantifikaci heteroplasmie a posoudí spolehlivost a reprodukovatelnost techniky. Po dosažení validace bude digitální PCR testována na DNA extrahované z mikrodisekovaných svalových vláken stejných pacientů, aby se vyhodnotila její proveditelnost na úrovni jednotlivých vláken, s porovnáním s výsledky PCR-RFLP. Pokud bude proveditelnost na úrovni jednotlivých vláken potvrzena, bude metoda následně testována u čtyř nových pacientů z Referenčního centra pro mitochondriální onemocnění, u nichž byly identifikovány varianty s nejistým významem a u kterých jsou k dispozici svalové biopsie s COX-negativními vlákny. Budou odebrány další vzorky (krev, moč a stěry z ústní dutiny) k posouzení úrovní heteroplasmie v různých tkáních. Pokud bude validována, mohla by být tato technika aplikována na větší počet pacientů a integrována do diagnostické strategie pro mitochondriální onemocnění.

Navíc by digitální PCR mohla být také použita ke kvantifikaci počtu kopií mtDNA, což je nezbytný biomarker pro sledování pacientů s MD. K tomuto účelu je mtDNA rozdělena do tisíců nanodutin a absolutní kvantifikace je získána počítáním fluorescenčních signálů emitovaných pozitivními oddíly, přičemž sonda jaderné DNA slouží jako interní kontrola. Tato validace bude provedena pomocí stejných krevních vzorků a svalových vláken porovnáním výsledků digitální PCR s výsledky získanými pomocí referenční metody, kvantitativní PCR (qPCR).

Hlavním cílem této studie je zkrátit diagnostické odyseje zjednodušením stávajících metod. Kromě toho by aplikace digitální PCR ke kvantifikaci počtu kopií mtDNA mohla nabídnout nové perspektivy, zejména jako biomarker pro monitorování pacientů a vývoj klinických studií.