Sviluppo di una nuova tecnica per quantificare il DNA mitocondriale in singole fibre muscolari (DIGITAL_MITO)

Le malattie mitocondriali (MD) sono i disturbi metabolici più comuni. A causa della loro grande eterogeneità clinica e genetica, la loro diagnosi si basa esclusivamente sull'identificazione di varianti patogeniche in geni nucleari o nel DNA mitocondriale (mtDNA). Tuttavia, ad oggi, il 50% dei pazienti affetti rimane senza una diagnosi definitiva. L'avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha migliorato la resa diagnostica, ma molte varianti identificate rimangono di significato incerto (VUS), impedendo una diagnosi definitiva. L'interpretazione clinica di queste nuove varianti rare identificate rappresenta quindi una sfida importante.

Nel contesto delle MD, uno dei criteri principali per la patogenicità delle varianti di mtDNA è una buona correlazione tra il livello di eteroplasmia e il coinvolgimento tissutale o cellulare. L'eteroplasmia si riferisce alla coesistenza, all'interno della stessa cellula o tessuto, di molecole di mtDNA mutate e non mutate. Le varianti patogeniche di mtDNA sono molto spesso eteroplasmiche, con i tessuti più colpiti che ospitano una proporzione più elevata di mtDNA mutato. Nelle biopsie muscolari di pazienti con MD, le fibre muscolari possono mostrare una carenza enzimatica del citocromo c ossidasi (COX) (fibre COX-negative), riflettendo una disfunzione della catena respiratoria mitocondriale (MRC). L'analisi a fibra singola consente di isolare le fibre muscolari mediante microdissezione LASER e di quantificare il livello di eteroplasmia di una variante al loro interno. La presenza di un alto livello di eteroplasmia nelle fibre COX-negative, in contrasto con le fibre senza carenza (fibre COX-positive), è una forte evidenza a sostegno della patogenicità della variante. In progetti precedenti, abbiamo testato due tecniche di quantificazione delle varianti (PCR-RFLP e NGS), ma questi metodi rimangono troppo laboriosi o costosi e quindi difficili da mantenere nella pratica di routine.

Questo studio pilota mira a sviluppare un nuovo metodo per quantificare i livelli di eteroplasmia utilizzando la PCR digitale. Più veloce e meno costoso, questo approccio potrebbe semplificare l'implementazione tecnica e ridurre i costi di analisi, facilitando così la sua integrazione nella pratica clinica. Inizialmente, uno studio di fattibilità inizierà con la validazione della PCR digitale sul DNA estratto da campioni di sangue di due pazienti portatori di varianti patogeniche identificate in uno studio precedente (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Questa validazione confronterà la PCR digitale con il metodo PCR-RFLP per la quantificazione dell'eteroplasmia e valuterà l'affidabilità e la riproducibilità della tecnica. Una volta ottenuta la validazione, la PCR digitale sarà testata sul DNA estratto da fibre muscolari microdissezionate degli stessi pazienti per valutarne la fattibilità a livello di fibra singola, con confronto con i risultati della PCR-RFLP. Se la fattibilità a livello di fibra singola sarà confermata, il metodo sarà quindi testato in quattro nuovi pazienti del Centro di Riferimento per le Malattie Mitocondriali, in cui sono state identificate varianti di significato incerto e per i quali sono disponibili biopsie muscolari con fibre COX-negative. Ulteriori campioni (sangue, urina e tamponi buccali) saranno raccolti per valutare i livelli di eteroplasmia in diversi tessuti. Se validata, questa tecnica potrebbe essere applicata a un numero maggiore di pazienti e integrata nella strategia diagnostica per le malattie mitocondriali.

Inoltre, la PCR digitale potrebbe anche essere utilizzata per quantificare il numero di copie di mtDNA, un biomarcatore essenziale per il monitoraggio dei pazienti con MD. A tal fine, l'mtDNA viene suddiviso in migliaia di nanopozi, e la quantificazione assoluta si ottiene contando i segnali fluorescenti emessi dalle partizioni positive, con una sonda di DNA nucleare che funge da controllo interno. Questa validazione sarà eseguita utilizzando gli stessi campioni di sangue e fibre muscolari, confrontando i risultati della PCR digitale con quelli ottenuti utilizzando il metodo di riferimento, la PCR quantitativa (qPCR).

L'obiettivo primario di questo studio è ridurre le odissee diagnostiche semplificando i metodi esistenti. Inoltre, l'applicazione della PCR digitale per quantificare il numero di copie di mtDNA potrebbe offrire nuove prospettive, in particolare come biomarcatore per il monitoraggio dei pazienti e lo sviluppo di studi clinici.