단일 근섬유 내 미토콘드리아 DNA 정량화를 위한 새로운 기술 개발 (DIGITAL_MITO)
단일 근육 섬유에서 미토콘드리아 DNA를 정량화하는 새로운 기술 개발: 미토콘드리아 질환의 불확실한 중요성 변이 해석을 위한 도구로
미토콘드리아 질환(MDs)은 가장 흔한 대사 장애입니다. 이 질환들은 임상적 및 유전적 이질성이 매우 크기 때문에, 진단은 핵 유전자 또는 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 병원성 변이 확인에 전적으로 의존합니다. 그러나 현재까지도 50%의 환자가 확정 진단을 받지 못하고 있습니다. 차세대 염기서열 분석(NGS)의 도입으로 진단율이 향상되었지만, 많은 확인된 변이는 불확실한 의의(VUS)를 지녀 확정 진단을 방해합니다. 따라서 이러한 새로 확인된 희귀 변이의 임상적 해석은 주요 과제입니다.
MDs의 맥락에서 mtDNA 변이 병원성의 주요 기준 중 하나는 이형질성 수준과 조직 또는 세포 침범 간의 좋은 상관관계입니다. 이형질성은 동일 세포 또는 조직 내에서 변이된 mtDNA 분자와 비변이 mtDNA 분자가 공존하는 것을 의미합니다. 병원성 mtDNA 변이는 대부분 이형질성을 보이며, 가장 많이 침범된 조직은 더 높은 비율의 변이 mtDNA를 포함합니다. MDs 환자의 근육 생검에서 근섬유는 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC)의 기능 장애를 반영하는 시토크롬 c 산화효소(COX) 효소 결핍(COX 음성 섬유)을 보일 수 있습니다. 단일 섬유 분석은 LASER 미세 절제로 근육 섬유를 분리하고 그 내에서 변이의 이형질성 수준을 정량화할 수 있게 합니다. 결핍이 없는 섬유(COX 양성 섬유)와 대조적으로 COX 음성 섬유에서 높은 이형질성 수준의 존재는 변이의 병원성을 지지하는 강력한 증거입니다. 이전 프로젝트에서 우리는 두 가지 변이 정량화 기술(PCR-RFLP 및 NGS)을 테스트했지만, 이러한 방법들은 여전히 너무 노동 집약적이거나 비용이 높아 일상 임상에서 유지하기 어렵습니다.
이 파일럿 연구는 디지털 PCR을 사용하여 이형질성 수준을 정량화하는 새로운 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 더 빠르고 저렴한 이 접근법은 기술적 구현을 단순화하고 분석 비용을 줄여 임상 실무 통합을 용이하게 할 수 있습니다. 초기에는, 이전 연구(AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45)에서 확인된 병원성 변이를 지닌 두 환자의 혈액 샘플에서 추출한 DNA에 대해 디지털 PCR 검증으로 시작하는 타당성 연구가 진행될 것입니다. 이 검증은 디지털 PCR을 이형질성 정량화를 위한 PCR-RFLP 방법과 비교하고, 기술의 신뢰성과 재현성을 평가할 것입니다. 검증이 완료되면, 동일 환자의 미세 절제된 근육 섬유에서 추출한 DNA에 대해 디지털 PCR을 테스트하여 단일 섬유 수준에서의 타당성을 PCR-RFLP 결과와 비교하여 평가할 것입니다. 단일 섬유 수준에서의 타당성이 확인되면, 이 방법은 미토콘드리아 질환 참조 센터의 네 명의 새로운 환자에게 테스트될 것입니다. 이 환자들은 불확실한 의의의 변이가 확인되었으며 COX 음성 섬유가 있는 근육 생검이 가능합니다. 추가 샘플(혈액, 소변, 구강 면봉)은 다양한 조직에서의 이형질성 수준을 평가하기 위해 수집될 것입니다. 검증되면, 이 기술은 더 많은 환자에게 적용되고 미토콘드리아 질환 진단 전략에 통합될 수 있습니다.
또한, 디지털 PCR은 MDs 환자 모니터링에 필수적인 생체 표지자인 mtDNA 복제 수를 정량화하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이를 위해, mtDNA는 수천 개의 나노웰로 분할되며, 양성 분할에서 방출되는 형광 신호를 계수하여 절대 정량화가 얻어집니다. 핵 DNA 프로브는 내부 대조군 역할을 합니다. 이 검증은 동일한 혈액 샘플과 근육 섬유를 사용하여, 디지털 PCR 결과를 기준 방법인 정량적 PCR(qPCR)로 얻은 결과와 비교하여 수행될 것입니다.
이 연구의 주요 목적은 기존 방법을 단순화하여 진단 과정의 복잡성을 줄이는 것입니다. 게다가, mtDNA 복제 수 정량화에 디지털 PCR을 적용하는 것은 환자 모니터링 및 임상 시험 개발을 위한 생체 표지자로서 특히 새로운 전망을 제공할 수 있습니다.
연구 개요
연구 유형
등록 (추정된)
단계
- 해당 없음
연락처 및 위치
연구 연락처
- 이름: Cécile Rouzier, MD-PhD
- 전화번호: +33 (0)4 92 03 62 43
- 이메일: rouzier.c@chu-nice.fr
연구 장소
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Bron, 프랑스, 69500
- Groupement Hospitalier Est Hospices civils de Lyon - Service de génétique médicale
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연락하다:
- Pauline Monin, Ph
- 전화번호: +33 (0)4 27 85 55 73
- 이메일: pauline.monin@chu-lyon.fr
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Montpellier, 프랑스, 34295
- Hôpital Gui de Chauliac - Service de Neurologie
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연락하다:
- Cecilia Marelli, Ph
- 전화번호: +33 (0)4 67 33 60 29
- 이메일: c-marelli@chu-montpellier.fr
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Provence-Alpes-Côte d'Azur Region
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Nice, Provence-Alpes-Côte d'Azur Region, 프랑스, 06202
- CHU de Nice - Service de Génétique Médicale
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연락하다:
- Cécile Rouzier, MD-PhD
- 전화번호: +33 (0)4 92 03 62 43
- 이메일: rouzier.c@chu-nice.fr
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연락하다:
- Claire Hoarau
- 전화번호: +33 (6)4 92 03 94 05
- 이메일: hoarau.c@chu-nice.fr
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참여기준
자격 기준
공부할 수 있는 나이
- 어린이
- 성인
- 고령자
건강한 자원 봉사자를 받아들입니다
설명
포함 기준:
- 성인 또는 미성년자 환자, 산발적 또는 고립된 사례
- 동의서 서명, 미성년자 환자의 경우: 부모 양쪽 또는 친권 보유자의 서명, 단 합리적인 기간 내에 부모 중 한 명의 동의를 얻는 것이 불가능한 경우 제외
- 사회 보장 제도 가입
미토콘드리아 질환 기준 센터의 임상의가 평가한 미토콘드리아 장애 의심, 다음 중 적어도 하나를 기반으로:
- 미토콘드리아 장애를 시사하는 임상적 증상 (비정상적인 증상 조합, MELAS와 같은 특정 증후군, 근육 약화, 안검하수 등) 및/또는
- 호흡 사슬 관여를 나타내는 대사 검사 및/또는
- 근육 생검에서 하나 이상의 호흡 사슬 복합체에 영향을 미치는 결함 확인.
- 이전에 확인된 미토콘드리아 DNA 변이의 불확실한 중요성(VUS)을 가진 환자.
- 적어도 5개의 COX 음성 섬유를 보이는 근육 생검의 조직학적 분석.
- 근육 생검 가능 및 병리학 실험실에서 슬라이드 회수 가능.
제외 기준:
- 연구 동의서 서명 거부.
- 연구 참여 목적 이외의 이유로 의료 또는 사회 시설에 입원한 개인.
- 법적 후견(후견, 보존) 대상 성인
- 임신 중이거나 수유 중인 여성
공부 계획
연구는 어떻게 설계됩니까?
디자인 세부사항
- 주 목적: 특수 증상
- 할당: 해당 없음
- 중재 모델: 단일 그룹 할당
- 마스킹: 없음(오픈 라벨)
무기와 개입
참가자 그룹 / 팔 |
개입 / 치료 |
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실험적: 미토콘드리아병 팔
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중재는 디지털 PCR(dPCR)을 사용하여 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이형성 수준과 mtDNA 복제 수를 정량화하는 것으로 구성됩니다. dPCR은 혈액, 소변, 구강(타액) 샘플에서 추출한 DNA와 근육 생검에서 얻은 레이저 미세 절단 단일 근육 섬유에서 추출한 DNA에 대해 수행됩니다. 이 방법은 참조 기술(이형성에 대한 PCR-RFLP 및 mtDNA 복제 수에 대한 정량적 PCR)과 비교하여 검증되어 정확성과 재현성을 평가합니다. dPCR은 이후 불확실한 중요성을 지닌 변이를 보유한 환자에게 적용되어 이형성 수준과 조직 침범 간의 상관관계를 평가함으로써 변이 병원성 평가를 지원합니다. 이 중재는 모든 샘플이 일상적인 임상 치료의 일부로 수집되므로 추가적인 침습적 절차를 포함하지 않습니다. |
연구는 무엇을 측정합니까?
주요 결과 측정
결과 측정 |
측정값 설명 |
기간 |
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진단 수율을 향상시키기 위해 단일 근육 섬유 내 변이의 이형질성 수준을 정량화하는 새로운 디지털 PCR 기술을 검증합니다.
기간: 포함 방문
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이전에 확인된 병원성 변이를 가진 두 환자에서 이질형성 수준을 정량화하기 위한 디지털 PCR과 PCR-RFLP 간 결과의 일치도.
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포함 방문
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2차 결과 측정
결과 측정 |
측정값 설명 |
기간 |
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미토콘드리아 DNA(mtDNA) 복사본 수를 정량화하는 새로운 디지털 PCR 기법 검증
기간: 포함 방문
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미토콘드리아 DNA 카피 수의 정량화에 대한 디지털 PCR과 qPCR 결과 간의 일치도는 p값 > 0.05인 Mann-Whitney 검정으로 평가한 결과, 두 기법 간에 차이가 없음을 나타냅니다.
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포함 방문
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공동 작업자 및 조사자
연구 기록 날짜
연구 주요 날짜
연구 시작 (추정된)
기본 완료 (추정된)
연구 완료 (추정된)
연구 등록 날짜
최초 제출
QC 기준을 충족하는 최초 제출
처음 게시됨 (실제)
연구 기록 업데이트
마지막 업데이트 게시됨 (실제)
QC 기준을 충족하는 마지막 업데이트 제출
마지막으로 확인됨
추가 정보
이 연구와 관련된 용어
추가 관련 MeSH 약관
기타 연구 ID 번호
- 25-AOIP-01
개별 참가자 데이터(IPD) 계획
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약물 및 장치 정보, 연구 문서
미국 FDA 규제 의약품 연구
미국 FDA 규제 기기 제품 연구
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