Entwicklung einer neuen Technik zur Quantifizierung mitochondrialer DNA in einzelnen Muskelfasern (DIGITAL_MITO)

Mitochondriale Erkrankungen (MDs) sind die häufigsten Stoffwechselstörungen. Aufgrund ihrer großen klinischen und genetischen Heterogenität beruht ihre Diagnose ausschließlich auf der Identifizierung pathogener Varianten in Kern-Genen oder in mitochondrialer DNA (mtDNA). Bis heute bleiben jedoch 50% der betroffenen Patienten ohne endgültige Diagnose. Die Einführung der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat die diagnostische Ausbeute verbessert, aber viele identifizierte Varianten bleiben von unklarer Signifikanz (VUS), was eine endgültige Diagnose verhindert. Die klinische Interpretation dieser neu identifizierten seltenen Varianten stellt daher eine große Herausforderung dar.

Im Kontext von MDs ist eines der Hauptkriterien für die Pathogenität von mtDNA-Varianten eine gute Korrelation zwischen Heteroplasmie-Level und Gewebe- oder Zellbeteiligung. Heteroplasmie bezieht sich auf die Koexistenz von mutierten und nicht-mutierten mtDNA-Molekülen innerhalb derselben Zelle oder desselben Gewebes. Pathogene mtDNA-Varianten sind meist heteroplasmisch, wobei die am stärksten betroffenen Gewebe einen höheren Anteil an mutierter mtDNA aufweisen. In Muskelbiopsien von Patienten mit MDs können Muskelfasern einen Cytochrom-c-Oxidase (COX)-enzymatischen Mangel (COX-negative Fasern) zeigen, was eine Dysfunktion der mitochondrialen Atmungskette (MRC) widerspiegelt. Die Einzelfaseranalyse ermöglicht es, Muskelfasern durch LASER-Mikrodissektion zu isolieren und den Heteroplasmie-Level einer Variante darin zu quantifizieren. Das Vorhandensein eines hohen Heteroplasmie-Levels in COX-negativen Fasern, im Gegensatz zu Fasern ohne Mangel (COX-positive Fasern), ist ein starker Beweis für die Pathogenität der Variante. In früheren Projekten haben wir zwei Varianten-Quantifizierungstechniken (PCR-RFLP und NGS) getestet, aber diese Methoden bleiben zu arbeitsintensiv oder kostspielig und sind daher in der Routinepraxis schwer aufrechtzuerhalten.

Diese Pilotstudie zielt darauf ab, eine neue Methode zur Quantifizierung von Heteroplasmie-Levels mittels digitaler PCR zu entwickeln. Schneller und kostengünstiger könnte dieser Ansatz die technische Umsetzung vereinfachen und die Analysekosten senken, wodurch die Integration in die klinische Praxis erleichtert wird. Zunächst beginnt eine Machbarkeitsstudie mit der Validierung der digitalen PCR an DNA, die aus Blutproben von zwei Patienten extrahiert wurde, die pathogene Varianten tragen, die in einer früheren Studie identifiziert wurden (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Diese Validierung wird digitale PCR mit der PCR-RFLP-Methode zur Heteroplasmie-Quantifizierung vergleichen und die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Technik bewerten. Nach erfolgreicher Validierung wird digitale PCR an DNA getestet, die aus mikrodissezierten Muskelfasern derselben Patienten extrahiert wurde, um ihre Machbarkeit auf Einzelfaserebene zu bewerten, mit Vergleich zu PCR-RFLP-Ergebnissen. Wenn die Machbarkeit auf Einzelfaserebene bestätigt wird, wird die Methode dann an vier neuen Patienten vom Referenzzentrum für Mitochondriale Erkrankungen getestet, bei denen Varianten unklarer Signifikanz identifiziert wurden und für die Muskelbiopsien mit COX-negativen Fasern verfügbar sind. Zusätzliche Proben (Blut, Urin und Wangenabstriche) werden gesammelt, um Heteroplasmie-Level in verschiedenen Geweben zu beurteilen. Wenn validiert, könnte diese Technik auf eine größere Anzahl von Patienten angewendet und in die Diagnosestrategie für mitochondriale Erkrankungen integriert werden.

Darüber hinaus könnte digitale PCR auch zur Quantifizierung der mtDNA-Kopienzahl verwendet werden, einem essenziellen Biomarker zur Überwachung von Patienten mit MDs. Zu diesem Zweck wird mtDNA in Tausende von Nanowells partitioniert, und die absolute Quantifizierung wird durch Zählen fluoreszierender Signale von positiven Partitionen erhalten, wobei eine Kern-DNA-Sonde als interne Kontrolle dient. Diese Validierung wird unter Verwendung derselben Blutproben und Muskelfasern durchgeführt, indem digitale PCR-Ergebnisse mit denen der Referenzmethode, quantitativer PCR (qPCR), verglichen werden.

Das primäre Ziel dieser Studie ist es, diagnostische Odysseen durch Vereinfachung bestehender Methoden zu reduzieren. Zusätzlich könnte die Anwendung von digitaler PCR zur Quantifizierung der mtDNA-Kopienzahl neue Perspektiven bieten, insbesondere als Biomarker für die Patientenüberwachung und die Entwicklung klinischer Studien.