Desenvolvimento de uma Nova Técnica para Quantificar o ADN Mitocondrial em Fibras Musculares Individuais (DIGITAL_MITO)

As doenças mitocondriais (DM) são as doenças metabólicas mais comuns. Devido à sua grande heterogeneidade clínica e genética, o seu diagnóstico depende exclusivamente da identificação de variantes patogénicas em genes nucleares ou no ADN mitocondrial (ADNmt). No entanto, até à data, 50% dos doentes afetados permanecem sem um diagnóstico definitivo. O advento do sequenciamento de nova geração (NGS) melhorou o rendimento diagnóstico, mas muitas variantes identificadas permanecem de significado incerto (VUS), impedindo um diagnóstico definitivo. A interpretação clínica destas novas variantes raras identificadas representa, portanto, um grande desafio.

No contexto das DM, um dos principais critérios para a patogenicidade de uma variante do ADNmt é uma boa correlação entre o nível de heteroplasmia e o envolvimento tecidular ou celular. A heteroplasmia refere-se à coexistência, dentro da mesma célula ou tecido, de moléculas de ADNmt mutadas e não mutadas. As variantes patogénicas do ADNmt são na maioria das vezes heteroplásmicas, com os tecidos mais afetados a apresentarem uma proporção mais elevada de ADNmt mutado. Em biópsias musculares de doentes com DM, as fibras musculares podem apresentar uma deficiência enzimática do citocromo c oxidase (COX) (fibras COX-negativas), refletindo uma disfunção da cadeia respiratória mitocondrial (CRM). A análise de fibra única permite isolar fibras musculares por microdissecção LASER e quantificar o nível de heteroplasmia de uma variante dentro delas. A presença de um nível elevado de heteroplasmia em fibras COX-negativas, em contraste com fibras sem deficiência (fibras COX-positivas), é uma forte evidência que apoia a patogenicidade da variante. Em projetos anteriores, testámos duas técnicas de quantificação de variantes (PCR-RFLP e NGS), mas estes métodos permanecem demasiado trabalhosos ou dispendiosos e, portanto, difíceis de manter na prática de rotina.

Este estudo piloto visa desenvolver um novo método para quantificar níveis de heteroplasmia utilizando PCR digital. Mais rápida e menos dispendiosa, esta abordagem poderá simplificar a implementação técnica e reduzir os custos de análise, facilitando assim a sua integração na prática clínica. Inicialmente, um estudo de viabilidade começará com a validação do PCR digital em ADN extraído de amostras de sangue de dois doentes portadores de variantes patogénicas identificadas num estudo anterior (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Esta validação comparará o PCR digital com o método PCR-RFLP para quantificação da heteroplasmia e avaliará a fiabilidade e reprodutibilidade da técnica. Uma vez alcançada a validação, o PCR digital será testado em ADN extraído de fibras musculares microdissecadas dos mesmos doentes para avaliar a sua viabilidade ao nível da fibra única, com comparação com os resultados da PCR-RFLP. Se a viabilidade ao nível da fibra única for confirmada, o método será então testado em quatro novos doentes do Centro de Referência de Doenças Mitocondriais, nos quais foram identificadas variantes de significado incerto e para os quais estão disponíveis biópsias musculares com fibras COX-negativas. Amostras adicionais (sangue, urina e zaragatoas bucais) serão recolhidas para avaliar os níveis de heteroplasmia em diferentes tecidos. Se validada, esta técnica poderá ser aplicada a um número maior de doentes e integrada na estratégia de diagnóstico das doenças mitocondriais.

Além disso, o PCR digital também poderá ser utilizado para quantificar o número de cópias do ADNmt, um biomarcador essencial para o acompanhamento de doentes com DM. Para este fim, o ADNmt é particionado em milhares de nanopoços, e a quantificação absoluta é obtida contando os sinais fluorescentes emitidos pelas partições positivas, com uma sonda de ADN nuclear a servir como controlo interno. Esta validação será realizada utilizando as mesmas amostras de sangue e fibras musculares, comparando os resultados do PCR digital com os obtidos utilizando o método de referência, a PCR quantitativa (qPCR).

O objetivo principal deste estudo é reduzir as odisseias de diagnóstico simplificando os métodos existentes. Além disso, a aplicação do PCR digital para quantificar o número de cópias do ADNmt poderá oferecer novas perspetivas, particularmente como biomarcador para o acompanhamento de doentes e o desenvolvimento de ensaios clínicos.