Utveckling av en ny teknik för kvantifiering av mitokondriellt DNA i enskilda muskelceller (DIGITAL_MITO)

Mitokondriella sjukdomar (MD) är de vanligaste metaboliska störningarna. På grund av deras stora kliniska och genetiska heterogenitet baseras deras diagnos uteslutande på identifiering av patogena varianter i nukleära gener eller i mitokondriellt DNA (mtDNA). Dock förblir 50 % av drabbade patienter än idag utan en definitiv diagnos. Införandet av nästa generations sekvensering (NGS) har förbättrat diagnostisk utbyte, men många identifierade varianter förblir av osäker betydelse (VUS), vilket förhindrar en definitiv diagnos. Den kliniska tolkningen av dessa nyligen identifierade sällsynta varianter utgör därför en stor utmaning.

I samband med MD är ett av de viktigaste kriterierna för mtDNA-variantens patogenicitet en god korrelation mellan heteroplasmisk nivå och vävnads- eller cellulär inblandning. Heteroplasmi avser samexistensen, inom samma cell eller vävnad, av muterade och icke-muterade mtDNA-molekyler. Patogena mtDNA-varianter är oftast heteroplasmiska, där de mest drabbade vävnaderna har en högre andel muterat mtDNA. I muskelbiopsier från patienter med MD kan muskelceller visa ett cytochrom c-oxidas (COX) enzymatisk brist (COX-negativa celler), vilket reflekterar dysfunktion i den mitokondriella respiratorkedjan (MRC). Enskild fibersanalys möjliggör isolering av muskelceller genom LASER-mikrodissektion och kvantifiering av heteroplasmisk nivå för en variant inom dem. Närvaron av en hög heteroplasmisk nivå i COX-negativa celler, i motsats till celler utan brist (COX-positiva celler), är starkt bevis som stöder variantens patogenicitet. I tidigare projekt testade vi två variantkvantifieringstekniker (PCR-RFLP och NGS), men dessa metoder förblir för arbetsintensiva eller kostsamma och är därför svåra att upprätthålla i rutinpraktik.

Denna pilotstudie syftar till att utveckla en ny metod för kvantifiering av heteroplasminivåer med digital PCR. Snabbare och billigare, detta tillvägagångssätt skulle kunna förenkla teknisk implementering och minska analyskostnader, vilket underlättar dess integration i klinisk praxis. Inledningsvis kommer en genomförbarhetsstudie att börja med validering av digital PCR på DNA extraherat från blodprover från två patienter som bär patogena varianter identifierade i en tidigare studie (AOI 2017 IDRCB: 2017-A00688-45). Denna validering kommer att jämföra digital PCR med PCR-RFLP-metoden för heteroplasmikvantifiering och bedöma teknikens tillförlitlighet och reproducerbarhet. När valideringen är uppnådd kommer digital PCR att testas på DNA extraherat från mikrodissikerade muskelceller från samma patienter för att utvärdera dess genomförbarhet på enskild fibernivå, med jämförelse mot PCR-RFLP-resultat. Om genomförbarhet på enskild fibernivå bekräftas kommer metoden sedan att testas på fyra nya patienter från Referenscentrum för Mitokondriella Sjukdomar, hos vilka varianter av osäker betydelse har identifierats och för vilka muskelbiopsier med COX-negativa celler finns tillgängliga. Ytterligare prover (blod, urin och munhålesvabb) kommer att samlas in för att bedöma heteroplasminivåer över olika vävnader. Om validerad skulle denna teknik kunna tillämpas på ett större antal patienter och integreras i diagnostisk strategi för mitokondriella sjukdomar.

Dessutom skulle digital PCR också kunna användas för att kvantifiera mtDNA-kopienummer, en viktig biomarkör för övervakning av patienter med MD. För detta ändamål partitioneras mtDNA i tusentals nanobrunnar, och absolut kvantifiering erhålls genom att räkna fluorescerande signaler utsända av positiva partitioner, med en nukleärt DNA-probe som tjänar som intern kontroll. Denna validering kommer att utföras med samma blodprover och muskelceller, genom att jämföra digital PCR-resultat med de som erhållits med referensmetoden, kvantitativ PCR (qPCR).

Det primära målet med denna studie är att minska diagnostiska odysséer genom att förenkla befintliga metoder. Dessutom skulle tillämpningen av digital PCR för att kvantifiera mtDNA-kopienummer kunna erbjuda nya perspektiv, särskilt som biomarkör för patientövervakning och utveckling av kliniska prövningar.