제2형 당뇨병 환자의 아연 보충

연구 참여자

싱가포르 국립 대학 병원의 외래 환자 클리닉에서 모집된 40명의 남성 2형 당뇨병 환자는 무작위로 글루콘산 아연 100mg(GNC, 미국) 또는 위약(99% 미세 결정질 셀룰로오스, 1% 스테아린산 마그네슘) 정제 2개를 투여받게 됩니다. 3개월 동안 매일. 제2형 진성 당뇨병의 진단을 위한 미국 당뇨병 협회 기준을 충족하는 21세 이상의 피험자가 본 연구에 포함될 것이다. 일반의약품 또는 처방약, 비타민/미네랄 보충제 또는 전통 중국 요법을 섭취했거나 연구 시작 전 30일 이내에 급성 감염을 앓았거나 활동성 신경정신병 또는 혈액학적 진단을 받은 사람은 제외됩니다. 질병, 헤모글로빈이 10g/dL 미만, 이전에 마약을 사용했거나 주당 14단위를 초과하는 규칙적인 알코올 섭취가 있었습니다. 각 참가자는 본 연구에 참여하기 전에 서면 동의서를 제공합니다.

혈액 및 소변의 보충 및 샘플링

병원 연구 약사는 순응도를 평가하기 위해 할당된 치료 그룹을 무작위화하고 눈을 멀게 하고 나머지 알약을 세는 작업에 참여합니다. 기준선(보충 전)에서 8시간 단식 후, 3일과 7일, 1개월, 2개월, 3개월, 아연 또는 위약 섭취 후 1개월(워시아웃) 후에 혈액 및 반점 소변 샘플을 채취합니다. 혈액의 분취량은 각각 혈청 또는 혈장 분리를 위해 일반 또는 EDTA 튜브에 수집됩니다.

산화적 손상의 마커

EDTA 튜브에 수집된 혈액 샘플은 원심분리되고 인도메타신과 부틸화 하이드록시톨루엔이 혈장에 추가되고 신선한 소변 샘플이 폴리프로필렌 튜브에 배치됩니다. 준비된 샘플은 분석 전까지 -80oC에서 보관됩니다. 산화 스트레스 관련 바이오마커, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs 및 알란토인은 이전에 설명한 방법을 사용하여 가스 크로마토그래피-질량 분석법으로 측정됩니다. 간단히 말해서, 혼합된 무거운 동위원소, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP(Vanderbilt University의 Eiscosanoid Core Laboratory의 Jason D. Morrow 교수(사망)로부터의 선물), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 및 아라키돈산-d8 및 도코사헥사엔산-d5, 및 7-OH 콜레스테롤-d7, 24- OH 콜레스테롤-d7 및 26(27)-OH 콜레스테롤-d5 및 7-케토-콜레스테롤-d7은 산화 스트레스 마커의 정량화를 위해 혈장에 첨가됩니다. F2-IsoPs, F4-NPs 및 HETEs 생성물의 총(유리 및 에스테르화된) 형태를 측정하기 위해, 메탄올에서 제조된 1M 수산화칼륨을 혈장에 첨가하고(1:1) 37oC에서 30분 동안 가수분해를 수행합니다. 이후 메탄올, 5M HCl, 40mM 포름산(pH 4.6)을 순차적으로 첨가하여 혼합한다. 그런 다음 플라즈마 믹스는 음이온 교환 고체상 추출(SPE)을 사용하여 정제됩니다. 혈장 및 소변(F2-IsoPs 및 HETEs)의 유리 형태를 측정하기 위해 40mM 포름산(pH 4.5)을 혈장 또는 소변 샘플에 첨가하고 혼합한 다음 SPE로 정제합니다. 소변 F2-IsoP 및 HETE(Sigma Diagnostic kit, USA)를 표준화하기 위해 소변 크레아티닌 수치를 측정합니다.

정제된 샘플은 질량 선택 검출기(Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA)(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피(Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA)를 사용하여 유도체화되고 분석됩니다. F2-IsoP, F4-NP, HETE(5(S)-, 12(S)-, 15(S)- 및 20-HETE의 혼합물), 총 아라키돈산염 및 총 도코사헥사노에이트 측정의 경우, 음화학적 이온화(NCI) ) 모드를 적용하고 가교결합된 5% 페닐메틸실록산(HP-5, Agilent Technologies, USA)으로 코팅된 용융 실리카 모세관 컬럼에서 크로마토그래피 분리를 수행합니다. COP를 결정하기 위해 전자 이온화 모드를 적용하고 가교결합된 5% 페닐메틸실록산(Ultra 2 J&W, USA)으로 코팅된 용융 실리카 모세관 컬럼에서 크로마토그래피 분리를 수행합니다. 지질 산화 생성물의 농도는 관련 중수소화 내부 표준과 각 화합물의 피크 면적을 비교하여 계산됩니다.

알란토인 및 요산염 분석을 위해 25ul 혈장을 Nanosep 필터(10kDa)를 사용하여 원심분리하고 여액에 25ul 4mM 15N 알란토인 및 100ul 아세토니트릴을 첨가하고 혼합한 다음 질소 가스 하에서 건조합니다. 그런 다음 건조된 샘플을 피리딘(1:1 v/v) 내 N-(부틸-디메틸-실릴)-2,2,2-트리플루오로-N-메틸-아세트아미드(MTBSTFA) 50ml로 50oC에서 2분간 유도체화합니다. 시간. 알란토인은 GC-MS로 분석됩니다. 분리는 가교된 5% 페닐메틸실록산(Ultra 2, Agilent, USA)으로 코팅된 용융 실리카 모세관 컬럼에서 수행됩니다. 파생된 알란토인 샘플(1 μl)이 GC-MS에 주입됩니다. 알란토인의 정량화는 무거운 동위 원소와 비교하여 계산됩니다.

요산염 분석을 위해 80ul 물을 20ul 혈장에 첨가하고 혼합한 다음 Nanosep 필터(10kDa)를 사용하여 원심분리합니다. 그런 다음 여액을 UV 검출기에 연결된 HPLC(Agilent Technologies, USA)에 주입합니다. 크로마토그래피 분리는 2mM NH4H2PO4(pH 2.95)가 이동상으로 사용되는 등용매 조건에서 250mm Zorbax SB-C8 컬럼을 사용하여 달성됩니다. 용출된 요산 피크의 면적을 측정하고 순수 요산염을 첨가한 샘플로 구성된 선형 보정 곡선에 대해 농도를 결정합니다.

혈청 및 혈액학적 지표의 임상 파라미터

혈당, HbA1c 및 인슐린, 혈청 hsCRP, 콜레스테롤, LDL, HDL, 트리글리세라이드 및 철분은 Cobas C111 분석기(Roche Diagnostics, 스위스)를 사용하여 측정한다. 혈청 아연 및 구리 수준은 싱가포르 종합 병원의 진료 의뢰 실험실에서 결정되며 백혈구 및 적혈구 수, 헤모글로빈, 헤마토크리트 농도, 혈소판, 호중구 및 림프구는 Full Blood Count Analyzer(Sysmex, Japan)를 사용하여 평가됩니다. .

혈관 지수

맥파 분석 기술을 사용하여 대동맥압 및 증강 지수(AIx)를 결정합니다. Millar 안압계를 사용하여 요골 동맥에서 맥파 속도를 기록하고 요골 동맥 압력을 지속적으로 기록할 수 있는 SphygmoCor(SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australia)를 사용하여 데이터를 수집하고 분석합니다. 파형. AIx는 대동맥압 파형의 첫 번째 수축기 피크와 두 번째 수축기 피크 사이의 압력 차이를 계산된 대동맥 맥압으로 나누어 계산합니다.

혈장 질산염/아질산염의 측정은 Tsikas의 측정에서 채택될 것입니다. 요약하면, 혈장 헤비 라벨 15N NO3- 및 15N NO2- 200 μl에 800 μl 아세톤 및 100 μl 펜타플루오로벤질 브로마이드(PFBBr)를 첨가하고 혼합한 다음 50°C에서 60분 동안 배양합니다. 아세톤 부분을 질소 하에서 증발시킨 다음 500μl의 톨루엔을 첨가하고 1분 동안 격렬하게 혼합합니다. 유기 추출물은 4°C에서 5분 동안 2000rpm에서 원심분리하여 얻을 수 있습니다. 유도체화된 샘플은 GC-MS/NCI로 분석됩니다. 분리는 가교된 5% 페닐 메틸 실록산으로 코팅된 용융 실리카 모세관 컬럼에서 수행됩니다. 유도체화된 샘플(1µl)은 splitless 모드를 사용하여 GC 주입 포트에 주입됩니다. 질산염/아질산염의 정량화는 각 화합물의 피크 면적을 관련된 무거운 표지 내부 표준 15N NO3- 및 15N NO2-와 비교하여 계산됩니다.

통계 분석

통계 분석은 매킨토시용 GraphPad Prism 버전 5.0(GraphPad Prism Software, CA, USA)을 사용하여 수행될 것이다. 모든 값은 평균 SD로 표현됩니다. 짝을 이룬 학생의 t-테스트는 기준선과 보충 중 및 세척 기간 후에 각 시점 사이에 수행됩니다. Student's t-test로 감지된 중요한 변화는 시간 경과에 따른 아연의 영향을 평가하기 위해 반복 측정을 통해 ANOVA로 확인됩니다.