Sinktilskudd hos type 2-diabetikere

Studiedeltakere

Førti mannlige type 2-diabetikere, rekruttert fra poliklinikken ved National University Hospital, Singapore, vil bli randomisert til å motta to tabletter med enten 100 mg sinkglukonat (GNC, USA) eller placebo (99 % mikrokrystallinsk cellulose, 1 % magnesiumstearat) per dag i 3 måneder. Personer i alderen 21 år og eldre som oppfylte American Diabetes Association-kriteriene for diagnostisering av type 2 diabetes mellitus vil bli inkludert i denne studien. Vi vil ekskludere de som: hadde konsumert reseptfrie eller reseptbelagte legemidler, vitamin-/mineraltilskudd eller tradisjonelle kinesiske midler, lidd av akutt infeksjon mindre enn 30 dager før studiestart, hadde blitt diagnostisert med aktiv nevropsykiatrisk sykdom eller hematologisk sykdommer, hadde hemoglobin mindre enn 10g/dL, hadde tidligere bruk av narkotiske stoffer eller vanlig alkoholinntak i overkant av 14 enheter per uke. Hver deltaker vil gi skriftlig informert samtykke før de deltar i denne studien.

Tilskudd og prøvetaking av blod og urin

En sykehusfarmasøyt vil bli engasjert for å randomisere, blinde de tildelte behandlingsgruppene og telle de gjenværende tablettene for å vurdere samsvar. Blod- og punkturinprøver vil bli tatt etter en 8-timers faste ved baseline (før tilskudd), dag 3 og 7, måned 1, 2 og 3 under tilskudd og 1 måned etter inntak av sink eller placebo (utvasking). En aliquot av blod vil bli samlet i vanlige eller EDTA-rør for henholdsvis serum- eller plasmaseparasjon.

Markører for oksidativ skade

Blodprøver samlet inn i EDTA-rør vil bli sentrifugert, indometacin og butylert hydroksytoluen tilsatt plasma, og friske urinprøver plassert i polypropylenrør. De preparerte prøvene vil bli lagret ved -80oC frem til analyse. Oksidativt stress relaterte biomarkører, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs og allantoin, vil bli målt ved gasskromatografi-massespektrometri ved bruk av metoder som tidligere beskrevet. Kort fortalt, blandede tunge isotoper, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (gave fra prof. Jason D. Morrow (død), Eiscosanoid Core Laboratory ved Vanderbilt University), 5(S) )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 og arakidonsyre-d8 og dokosaheksaensyre-d5, og 7-OH kolesterol-d7, 24- OH-kolesterol-d7 og 26 (27)-OH-kolesterol-d5 og 7-keto-kolesterol-d7 vil bli tilsatt plasma for kvantifisering av oksidativt stressmarkører. For å måle de totale (frie og forestrede) formene av F2-IsoPs, F4-NPs og HETEs produkter, vil 1 M kaliumhydroksid fremstilt i metanol tilsettes plasma (1:1) og hydrolyse utføres ved 37oC i 30 minutter. Deretter vil metanol, 5 M HCl og 40 mM maursyre (pH 4,6) tilsettes sekvensielt og blandes. Plasmablandingen vil deretter renses ved bruk av anionisk utveksling av fastfaseekstraksjon (SPE). For å måle de frie formene i plasma og urin (F2-IsoPs og HETEs), vil 40 mM maursyre (pH 4,5) tilsettes plasma- eller urinprøven, blandes og deretter renses av SPE. Kreatininnivåer i urinen vil bli målt for å standardisere urin F2-IsoPs og HETEs (Sigma Diagnostic kit, USA).

De rensede prøvene vil deretter bli derivatisert og analysert ved bruk av gasskromatografi (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) koblet til en masseselektiv detektor (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). For F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs (en blanding av 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- og 20-HETEs), og total arakidonat og total dokosaheksanoatmålinger, negativ kjemisk ionisering (NCI) )-modus vil bli brukt og kromatografiske separasjoner vil bli utført på en kapillærkolonne av smeltet silika belagt med tverrbundet 5 % fenylmetylsiloksan (HP-5, Agilent Technologies, USA). For å bestemme COP-er vil elektronioniseringsmodus brukes og kromatografiske separasjoner utføres på en kapillærkolonne av smeltet silika belagt med tverrbundet 5% fenylmetylsiloksan (Ultra 2 J&W, USA). Konsentrasjoner av lipidoksidasjonsproduktene vil bli beregnet ved å sammenligne topparealet til hver forbindelse med den relevante deutererte interne standarden.

For allantoin- og uratanalyse vil 25 ul plasma bli sentrifugert ved bruk av Nanosep-filtre (10 kDa) og til filtratet vil 25 ul 4 mM 15N allantoin og 100 ul acetonitril tilsettes, blandes og deretter tørkes under nitrogengass. Den tørkede prøven vil deretter bli derivatisert med 50 ml N-(butyl-dimetyl-silyl)-2,2,2-trifluor-N-metyl-acetamid (MTBSTFA) i pyridin (1:1 v/v) ved 50oC i 2 h. Allantoin vil bli analysert av GC-MS. Separasjoner vil bli utført på en kapillærkolonne av smeltet silika belagt med tverrbundet 5 % fenylmetylsiloksan (Ultra 2, Agilent, USA). Derivatiserte allantoinprøver (1 µl) vil bli injisert i GC-MS. Kvantifisering av allantoin vil bli beregnet ved sammenligning med den tunge isotopen.

For uratanalyse vil 80 ul vann tilsettes 20 ul plasma, blandes og deretter sentrifugeres ved bruk av Nanosep-filtre (10 kDa). Filtratet vil deretter injiseres i en HPLC (Agilent Technologies, USA) koblet til en UV-detektor. Kromatografisk separasjon vil bli oppnådd ved å bruke 250 mm Zorbax SB-C8 kolonner under isokratiske forhold hvor 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95) vil bli brukt for den mobile fasen. Arealet av den eluerte urinsyretoppen vil bli målt og konsentrasjonen bestemt mot den lineære kalibreringskurven konstruert med prøvene tilsatt rent urat.

Kliniske parametere for serum og hematologiske indekser

Blodsukker, HbA1c og insulin, serum hsCRP, kolesterol, LDL, HDL, triglyserid og jern vil bli målt ved hjelp av Cobas C111 analysator (Roche Diagnostics, Sveits). Serumsink- og kobbernivåer vil bli bestemt ved henvisningslaboratoriet ved Singapore General Hospital, og hvite og røde blodverdier, hemoglobin, hematokritkonsentrasjoner, blodplater, nøytrofiler og lymfocytter, vil bli vurdert ved hjelp av Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japan) .

Vaskulære indekser

Teknikken med pulsbølgeanalyse vil bli brukt til å bestemme aortatrykket og augmentasjonsindeksen (AIx). Pulsbølgehastighetsregistreringer vil bli gjort fra den radiale arterien ved hjelp av et Millar-tonometer, og data vil bli samlet inn og analysert ved hjelp av SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australia), som tillot kontinuerlig registrering av det radiale arterietrykket. bølgeform. AIx vil bli beregnet ved å dele forskjellen i trykk mellom den første og andre systoliske toppen av aortatrykkbølgeformen med det beregnede aortapulstrykket.

Måling av plasmanitrat/nitritt vil bli tilpasset fra Tsikas. Kort oppsummert, til 200 µl av plasma tung merking vil 15N NO3- og 15N NO2- tilsettes, 800 µl aceton og 100 µl pentafluorbenzylbromid (PFBBr) tilsettes, blandes og inkuberes ved 50°C i 60 minutter. Acetondelen vil bli fordampet under nitrogen og deretter tilsettes 500 µl toluen og blandes kraftig i 1 min. Det organiske ekstraktet oppnås ved sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter ved 4°C. Derivatiserte prøver vil bli analysert av GC-MS/NCI. Separasjoner vil bli utført på en kapillærkolonne av smeltet silika belagt med tverrbundet 5 % fenylmetylsiloksan. Derivatiserte prøver (1 µl) vil bli injisert inn i GC-injeksjonsporten ved bruk av splitless-modus. Kvantifisering av nitrat/nitritt vil bli beregnet ved å sammenligne topparealet til hver forbindelse med den relevante tunge merkede interne standarden 15N NO3- og 15N NO2-.

statistiske analyser

Statistisk analyse vil bli utført med GraphPad Prism versjon 5.0 for Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA). Alle verdier vil bli uttrykt som gjennomsnittlig SD. Paret Students t-test vil bli utført mellom baseline og hvert tidspunkt under tilskudd og etter utvaskingsperioden. Eventuelle vesentlige endringer oppdaget av Students t-test vil bli bekreftet av ANOVA med gjentatte tiltak for å vurdere effekten av sink over tid.