Zinktillskott hos typ 2-diabetiker

Studiedeltagare

Fyrtio manliga typ 2-diabetiker, rekryterade från polikliniken vid National University Hospital, Singapore, kommer att randomiseras för att få två tabletter med antingen 100 mg zinkglukonat (GNC, USA) eller placebo (99 % mikrokristallin cellulosa, 1 % magnesiumstearat) per dag i 3 månader. Försökspersoner i åldern 21 år och äldre som uppfyllde American Diabetes Associations kriterier för diagnos av typ 2-diabetes mellitus kommer att inkluderas i denna studie. Vi kommer att utesluta de som: hade konsumerat receptfria eller receptbelagda läkemedel, vitamin-/mineraltillskott eller traditionella kinesiska läkemedel, drabbats av akut infektion mindre än 30 dagar innan studiens början, hade diagnostiserats med aktiv neuropsykiatrisk sjukdom eller hematologisk sjukdomar, hade hemoglobin mindre än 10 g/dL, tidigare använt narkotiska läkemedel eller regelbundet alkoholintag över 14 enheter per vecka. Varje deltagare kommer att ge skriftligt informerat samtycke innan de deltar i denna studie.

Tillskott och provtagning av blod och urin

En forskningsapotekare på sjukhus kommer att anlitas för att randomisera, blinda de tilldelade behandlingsgrupperna och räkna de återstående tabletterna för att bedöma efterlevnaden. Blod- och punkturinprov kommer att tas efter 8 timmars fasta vid baslinjen (före tillskott), dag 3 och 7, månader 1, 2 och 3 under tillskott och 1 månad efter intag av zink eller placebo (uttvättning). En alikvot blod kommer att samlas upp i vanliga eller EDTA-rör för serum- respektive plasmaseparation.

Markörer för oxidativ skada

Blodprover som samlas in i EDTA-rör kommer att centrifugeras, indometacin och butylerad hydroxytoluen tillsätts i plasman och färska urinprover placeras i polypropylenrör. De preparerade proverna kommer att förvaras vid -80oC fram till analys. Oxidativ stress relaterade biomarkörer, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs och allantoin, kommer att mätas med gaskromatografi-masspektrometri med metoder som tidigare beskrivits. Kortfattat, blandade tunga isotoper, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (gåva från Prof. Jason D. Morrow (död), Eiscosanoid Core Laboratory vid Vanderbilt University), 5(S) )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 och arakidonsyra-d8 och dokosahexaensyra-d5, och 7-OH-kolesterol-d7, 24- OH-kolesterol-d7 och 26 (27)-OH-kolesterol-d5 och 7-keto-kolesterol-d7 kommer att tillsättas i plasma för kvantifiering av markörerna för oxidativ stress. För att mäta de totala (fria och förestrade) formerna av F2-IsoPs, F4-NPs och HETEs produkter kommer 1 M kaliumhydroxid framställd i metanol att tillsättas till plasma (1:1) och hydrolys utförs vid 37oC under 30 minuter. Därefter kommer metanol, 5 M HCl och 40 mM myrsyra (pH 4,6) att tillsättas i tur och ordning och blandas. Plasmablandningen kommer sedan att renas med anjonbytesfastfasextraktion (SPE). För att mäta de fria formerna i plasma och urin (F2-IsoPs och HETEs), tillsätts 40 mM myrsyra (pH 4,5) till plasma- eller urinprovet, blandas och renas sedan med SPE. Kreatininnivåer i urinen kommer att mätas för att standardisera F2-IsoP och HETE i urinen (Sigma Diagnostic kit, USA).

De renade proverna kommer sedan att derivatiseras och analyseras med hjälp av gaskromatografi (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) kopplad till en massselektiv detektor (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). För F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs (en blandning av 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- och 20-HETEs), och totala arakidonat- och totala dokosahexanoatmätningar, negativ kemisk jonisering (NCI) ) kommer att tillämpas och kromatografiska separationer kommer att utföras på en kapillärkolonn av kondenserad kiseldioxid belagd med tvärbunden 5 % fenylmetylsiloxan (HP-5, Agilent Technologies, USA). För att bestämma COPs kommer elektronjoniseringssätt att tillämpas och kromatografiska separationer utföras på en kapillärkolonn av kondenserad kiseldioxid belagd med tvärbunden 5% fenylmetylsiloxan (Ultra 2 J&W, USA). Koncentrationer av lipidoxidationsprodukterna kommer att beräknas genom att jämföra topparean för varje förening med den relevanta deutererade interna standarden.

För allantoin- och uratanalys kommer 25 ul plasma att centrifugeras med Nanosep-filter (10 kDa) och till filtratet kommer 25 ul 4 mM 15N allantoin och 100 ul acetonitril att tillsättas, blandas och sedan torkas under kvävgas. Det torkade provet kommer sedan att derivatiseras med 50 ml N-(butyl-dimetyl-silyl)-2,2,2-trifluoro-N-metyl-acetamid (MTBSTFA) i pyridin (1:1 v/v) vid 50oC i 2 h. Allantoin kommer att analyseras med GC-MS. Separationer kommer att utföras på en kapillärkolonn av kondenserad kiseldioxid belagd med tvärbunden 5% fenylmetylsiloxan (Ultra 2, Agilent, USA). Derivatiserade allantoinprover (1 µl) kommer att injiceras i GC-MS. Kvantifiering av allantoin kommer att beräknas genom jämförelse med den tunga isotopen.

För uratanalys kommer 80 ul vatten att tillsättas till 20 ul plasma, blandas och sedan centrifugeras med Nanosep-filter (10 kDa). Filtratet kommer sedan att injiceras i en HPLC (Agilent Technologies, USA) kopplad till en UV-detektor. Kromatografisk separation kommer att uppnås med hjälp av 250 mm Zorbax SB-C8-kolonner under isokratiska förhållanden där 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95) kommer att användas för den mobila fasen. Arean av den eluerade urinsyratoppen kommer att mätas och koncentrationen bestäms mot den linjära kalibreringskurvan konstruerad med proverna spetsade med rent urat.

Kliniska parametrar för serum och hematologiska index

Blodsocker, HbA1c och insulin, serum-hsCRP, kolesterol, LDL, HDL, triglycerider och järn kommer att mätas med hjälp av Cobas C111-analysatorn (Roche Diagnostics, Schweiz). Nivåerna av zink och koppar i serum kommer att bestämmas vid remisslaboratoriet vid Singapore General Hospital, och vita och röda blodvärden, hemoglobin, hematokritkoncentrationer, blodplättar, neutrofiler och lymfocyter kommer att bedömas med hjälp av Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japan) .

Vaskulära index

Tekniken för pulsvågsanalys kommer att användas för att bestämma aortatrycket och förstärkningsindex (AIx). Pulsvågshastighetsregistreringar kommer att göras från den radiella artären med hjälp av en Millar-tonometer, och data kommer att samlas in och analyseras med hjälp av SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australien), som möjliggjorde kontinuerlig registrering av det radiella artärtrycket vågform. AIx kommer att beräknas genom att dividera skillnaden i tryck mellan den första och andra systoliska toppen av aortatryckvågformen med det beräknade aortapulstrycket.

Mätning av plasmanitrat/nitrit kommer att anpassas från Tsikas. I korthet, till 200 µl av plasma tung etikett kommer 15N NO3- och 15N NO2- att tillsättas, 800 µl aceton och 100 µl pentafluorbensylbromid (PFBBr) kommer att tillsättas, blandas och inkuberas vid 50°C i 60 minuter. Acetondelen kommer att indunstas under kväve och sedan tillsätts 500 µl toluen och blandas kraftigt i 1 min. Det organiska extraktet kommer att erhållas genom centrifugering vid 2000 rpm under 5 min vid 4°C. Derivatiserade prover kommer att analyseras av GC-MS/NCI. Separationer kommer att utföras på en kapillärkolonn av kondenserad kiseldioxid belagd med tvärbunden 5% fenylmetylsiloxan. Derivatiserade prover (1 µl) kommer att injiceras i GC-injektionsporten med ett splitless-läge. Kvantifiering av nitrat/nitrit kommer att beräknas genom att jämföra topparean för varje förening med relevant tungt märkt intern standard 15N NO3- och 15N NO2-.

Statistiska analyser

Statistisk analys kommer att utföras med GraphPad Prism version 5.0 för Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA). Alla värden kommer att uttryckas som medel SD. Parad Students t-test kommer att utföras mellan baslinjen och varje tidpunkt under tillskottet och efter tvättningsperioden. Alla betydande förändringar som upptäcks av Students t-test kommer att bekräftas av ANOVA med upprepade åtgärder för att bedöma effekterna av zink över tid.