Zinkergänzung bei Typ-2-Diabetikern

Studienteilnehmer

Vierzig männliche Typ-2-Diabetiker, die aus der Ambulanz des National University Hospital in Singapur rekrutiert wurden, werden randomisiert zwei Tabletten mit entweder 100 mg Zinkgluconat (GNC, USA) oder Placebo (99 % mikrokristalline Cellulose, 1 % Magnesiumstearat) erhalten. pro Tag für 3 Monate. Probanden ab 21 Jahren, die die Kriterien der American Diabetes Association für die Diagnose von Typ-2-Diabetes mellitus erfüllen, werden in diese Studie aufgenommen. Wir werden diejenigen ausschließen, die: rezeptfreie oder verschreibungspflichtige Medikamente, Vitamin-/Mineralstoffzusätze oder traditionelle chinesische Heilmittel eingenommen haben, weniger als 30 Tage vor Beginn der Studie eine akute Infektion erlitten haben, bei denen eine aktive neuropsychiatrische oder hämatologische Erkrankung diagnostiziert wurde Krankheiten, hatte einen Hämoglobinwert von weniger als 10 g/dL, hatte zuvor Drogenkonsum oder regelmäßigen Alkoholkonsum von mehr als 14 Einheiten pro Woche. Jeder Teilnehmer wird vor seiner Teilnahme an dieser Studie eine schriftliche Einverständniserklärung abgeben.

Ergänzung und Probenahme von Blut und Urin

Ein Krankenhaus-Forschungsapotheker wird beauftragt, die zugewiesenen Behandlungsgruppen zu randomisieren, zu verblinden und die verbleibenden Tabletten zu zählen, um die Compliance zu beurteilen. Blut- und Punkturinproben werden nach einer 8-stündigen Fastenzeit zu Studienbeginn (vor der Supplementierung), den Tagen 3 und 7, den Monaten 1, 2 und 3 während der Supplementierung und 1 Monat nach der Einnahme von Zink oder Placebo (Auswaschung) entnommen. Ein Aliquot Blut wird in einfachen oder EDTA-Röhrchen zur Serum- bzw. Plasmatrennung entnommen.

Marker für oxidative Schäden

In EDTA-Röhrchen gesammelte Blutproben werden zentrifugiert, Indomethacin und butyliertes Hydroxytoluol werden dem Plasma zugesetzt und frische Urinproben werden in Polypropylenröhrchen gegeben. Die vorbereiteten Proben werden bis zur Analyse bei -80oC gelagert. Mit oxidativem Stress in Zusammenhang stehende Biomarker, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs und Allantoin, werden durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden gemessen. Kurz gesagt, gemischte schwere Isotope, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (Geschenk von Prof. Jason D. Morrow (verstorben), Eiscosanoid Core Laboratory an der Vanderbilt University), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 und Arachidonsäure-d8 und Docosahexaensäure-d5 und 7-OH-Cholesterin-d7, 24- OH-Cholesterin-d7 und 26 (27)-OH-Cholesterin-d5 und 7-Keto-Cholesterin-d7 werden dem Plasma zur Quantifizierung der oxidativen Stressmarker zugesetzt. Um die gesamten (freien und veresterten) Formen von F2-IsoPs, F4-NPs und HETEs-Produkten zu messen, wird 1 M in Methanol zubereitetes Kaliumhydroxid zum Plasma (1:1) gegeben und die Hydrolyse 30 Minuten lang bei 37 °C durchgeführt. Danach werden nacheinander Methanol, 5 M HCl und 40 mM Ameisensäure (pH 4,6) zugegeben und gemischt. Die Plasmamischung wird dann mittels Anionenaustausch-Festphasenextraktion (SPE) gereinigt. Zur Messung der freien Formen in Plasma und Urin (F2-IsoPs und HETEs) werden der Plasma- oder Urinprobe 40 mM Ameisensäure (pH 4,5) zugesetzt, gemischt und anschließend durch SPE gereinigt. Der Kreatininspiegel im Urin wird gemessen, um die F2-IsoPs und HETEs im Urin zu standardisieren (Sigma Diagnostic Kit, USA).

Die gereinigten Proben werden dann derivatisiert und mittels Gaschromatographie (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) gekoppelt mit einem massenselektiven Detektor (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS) analysiert. Für F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs (eine Mischung aus 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- und 20-HETEs) und Gesamtarachidonat- und Gesamtdocosahexanoatmessungen negative chemische Ionisierung (NCI )-Modus angewendet und chromatographische Trennungen werden auf einer Fused-Silica-Kapillarsäule durchgeführt, die mit vernetztem 5%igem Phenylmethylsiloxan (HP-5, Agilent Technologies, USA) beschichtet ist. Zur Bestimmung der COPs werden der Elektronenionisationsmodus angewendet und chromatographische Trennungen auf einer Fused-Silica-Kapillarsäule durchgeführt, die mit vernetztem 5% Phenylmethylsiloxan (Ultra 2 J&W, USA) beschichtet ist. Die Konzentrationen der Lipidoxidationsprodukte werden berechnet, indem die Peakfläche jeder Verbindung mit dem entsprechenden deuterierten internen Standard verglichen wird.

Für die Allantoin- und Uratanalyse werden 25 ul Plasma unter Verwendung von Nanosep-Filtern (10 kDa) zentrifugiert und dem Filtrat werden 25 ul 4 mM 15 N Allantoin und 100 ul Acetonitril zugesetzt, gemischt und dann unter Stickstoffgas getrocknet. Die getrocknete Probe wird dann mit 50 ml N-(Butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluor-N-methyl-acetamid (MTBSTFA) in Pyridin (1:1 v/v) bei 50 °C für 2 derivatisiert H. Allantoin wird mittels GC-MS analysiert. Die Trennungen werden auf einer Fused-Silica-Kapillarsäule durchgeführt, die mit vernetztem 5%igem Phenylmethylsiloxan (Ultra 2, Agilent, USA) beschichtet ist. Proben von derivatisiertem Allantoin (1 µl) werden in das GC-MS injiziert. Die Quantifizierung von Allantoin wird durch Vergleich mit dem schweren Isotop berechnet.

Für die Uratanalyse werden 20 ul Plasma mit 80 ul Wasser versetzt, gemischt und anschließend mit Nanosep-Filtern (10 kDa) zentrifugiert. Das Filtrat wird dann in eine HPLC (Agilent Technologies, USA) injiziert, die mit einem UV-Detektor gekoppelt ist. Die chromatographische Trennung wird unter Verwendung von 250-mm-Zorbax-SB-C8-Säulen unter isokratischen Bedingungen erreicht, wobei 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95) für die mobile Phase verwendet wird. Die Fläche des eluierten Harnsäurepeaks wird gemessen und die Konzentration gegen die lineare Eichkurve bestimmt, die mit den mit reinem Urat versetzten Proben erstellt wurde.

Klinische Parameter des Serums und hämatologische Indizes

Blutzucker, HbA1c und Insulin, Serum-hsCRP, Cholesterin, LDL, HDL, Triglyzeride und Eisen werden mit dem Analysegerät Cobas C111 (Roche Diagnostics, Schweiz) gemessen. Die Zink- und Kupferspiegel im Serum werden im Referenzlabor des Singapore General Hospital bestimmt, und das weiße und rote Blutbild, Hämoglobin, Hämatokritkonzentrationen, Blutplättchen, Neutrophile und Lymphozyten werden mit dem Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japan) bewertet. .

Gefäßindizes

Zur Bestimmung des Aortendrucks und des Augmentationsindex (AIx) wird die Technik der Pulswellenanalyse eingesetzt. Pulswellengeschwindigkeitsaufzeichnungen werden von der Radialarterie mit einem Millar-Tonometer gemacht, und Daten werden mit dem SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australien) gesammelt und analysiert, das eine kontinuierliche Aufzeichnung des Radialarteriendrucks ermöglichte Wellenform. Der AIx wird berechnet, indem die Druckdifferenz zwischen der ersten und zweiten systolischen Spitze der Aortendruckkurve durch den berechneten Aortenpulsdruck dividiert wird.

Die Messung von Plasmanitrat/Nitrit wird von der von Tsikas übernommen. Kurz gesagt werden zu 200 ul Plasma-Schwermarkierung 15 N NO3- und 15 N NO2- hinzugefügt, 800 ul Aceton und 100 ul Pentafluorbenzylbromid (PFBBr) werden hinzugefügt, gemischt und bei 50ºC für 60 min inkubiert. Der Acetonanteil wird unter Stickstoff verdampft und dann werden 500 &mgr;l Toluol zugegeben und 1 Minute lang kräftig gemischt. Der organische Extrakt wird durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 2000 U/min bei 4 °C gewonnen. Derivatisierte Proben werden mit GC-MS/NCI analysiert. Die Trennungen werden auf einer Fused-Silica-Kapillarsäule durchgeführt, die mit vernetztem 5%igem Phenylmethylsiloxan beschichtet ist. Derivatisierte Proben (1 µl) werden im splitlosen Modus in den GC-Injektionsport injiziert. Die Quantifizierung von Nitrat/Nitrit wird berechnet, indem die Peakfläche jeder Verbindung mit dem relevanten stark markierten internen Standard 15N NO3- und 15N NO2- verglichen wird.

Statistische Analysen

Die statistische Analyse wird mit GraphPad Prism Version 5.0 für Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA) durchgeführt. Alle Werte werden als mittlere Standardabweichung ausgedrückt. Der t-Test des gepaarten Schülers wird zwischen der Grundlinie und jedem Zeitpunkt während der Supplementierung und nach der Auswaschphase durchgeführt. Alle signifikanten Veränderungen, die durch den Student-t-Test festgestellt werden, werden durch ANOVA mit wiederholten Messungen bestätigt, um die Auswirkungen von Zink im Laufe der Zeit zu bewerten.