Zinktilskud hos type 2-diabetikere

Studiedeltagere

Fyrre mandlige type 2-diabetikere, rekrutteret fra ambulatoriet på National University Hospital, Singapore, vil blive randomiseret til at modtage to tabletter af enten 100 mg zinkgluconat (GNC, USA) eller placebo (99 % mikrokrystallinsk cellulose, 1 % magnesiumstearat) om dagen i 3 måneder. Forsøgspersoner på 21 år og derover, som opfyldte American Diabetes Associations kriterier for diagnosticering af type 2 diabetes mellitus, vil blive inkluderet i denne undersøgelse. Vi vil udelukke dem, der: havde indtaget håndkøbsmedicin eller receptpligtig medicin, vitamin-/mineraltilskud eller traditionelle kinesiske midler, led af akut infektion mindre end 30 dage før starten af ​​undersøgelsen, var blevet diagnosticeret med aktiv neuropsykiatrisk sygdom eller hæmatologisk sygdomme, havde hæmoglobin under 10 g/dL, havde tidligere brug af narkotiske stoffer eller regelmæssigt alkoholindtag på over 14 enheder om ugen. Hver deltager skal give skriftligt informeret samtykke forud for deres deltagelse i denne undersøgelse.

Tilskud og prøveudtagning af blod og urin

En hospitalsforskningsfarmaceut vil blive engageret til at randomisere, blinde de tildelte behandlingsgrupper og tælle de resterende tabletter for at vurdere overensstemmelsen. Blod- og pleturinprøver vil blive taget efter en 8-timers faste ved baseline (før tilskud), dag 3 og 7, måned 1, 2 og 3 under tilskud og 1 måned efter indtagelse af zink eller placebo (udvaskning). En alikvot blod vil blive opsamlet i almindelige eller EDTA-rør til henholdsvis serum- eller plasmaseparation.

Markører for oxidativ skade

Blodprøver opsamlet i EDTA-rør vil blive centrifugeret, indomethacin og butyleret hydroxytoluen tilføjet til plasmaet, og friske urinprøver anbringes i polypropylenrør. De forberedte prøver vil blive opbevaret ved -80oC indtil analyse. Oxidativ stress relaterede biomarkører, F2-IsoP'er, F4-NP'er, HETE'er, COP'er og allantoin, vil blive målt ved gaskromatografi-massespektrometri ved hjælp af metoder som tidligere beskrevet. Kort fortalt blandede tunge isotoper, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (gave fra Prof. Jason D. Morrow (død), Eiscosanoid Core Laboratory ved Vanderbilt University), 5(S) )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 og arachidonsyre-d8 og docosahexaensyre-d5 og 7-OH-kolesterol-d7, 24- OH-cholesterol-d7 og 26 (27)-OH-cholesterol-d5 og 7-keto-cholesterol-d7 vil blive tilsat til plasma til kvantificering af de oxidative stress-markører. For at måle de samlede (frie og esterificerede) former af F2-IsoPs, F4-NPs og HETEs produkter, vil 1 M kaliumhydroxid fremstillet i methanol blive tilsat til plasma (1:1), og hydrolyse udføres ved 37oC i 30 minutter. Derefter tilsættes methanol, 5 M HCI og 40 mM myresyre (pH 4,6) sekventielt og blandes. Plasmablandingen vil derefter renses ved hjælp af anionbytter fastfaseekstraktion (SPE). For at måle de frie former i plasma og urin (F2-IsoP'er og HETE'er), vil 40 mM myresyre (pH 4,5) blive tilsat til plasma- eller urinprøven, blandet og derefter oprenset med SPE. Kreatininniveauer i urinen vil blive målt for at standardisere urin F2-IsoP'er og HETE'er (Sigma Diagnostic kit, USA).

De oprensede prøver vil derefter blive derivatiseret og analyseret ved hjælp af gaskromatografi (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) koblet til en masseselektiv detektor (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). For F2-IsoP'er, F4-NP'er, HETE'er (en blanding af 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- og 20-HETE'er) og målinger af total arachidonat og total docosahexanoat, negativ kemisk ionisering (NCI) ) metoden vil blive anvendt, og kromatografiske separationer vil blive udført på en fusioneret silica kapillar kolonne belagt med tværbundet 5% phenylmethylsiloxan (HP-5, Agilent Technologies, USA). For at bestemme COP'er vil elektronioniseringstilstand blive anvendt, og kromatografiske separationer udføres på en fusioneret silica-kapillærsøjle belagt med tværbundet 5% phenylmethylsiloxan (Ultra 2 J&W, USA). Koncentrationer af lipidoxidationsprodukterne vil blive beregnet ved at sammenligne toparealet af hver forbindelse med den relevante deutererede interne standard.

Til allantoin- og uratanalyse vil 25 ul plasma blive centrifugeret ved hjælp af Nanosep-filtre (10 kDa), og til filtratet vil 25 ul 4 mM 15N allantoin og 100 ul acetonitril blive tilsat, blandet og derefter tørret under nitrogengas. Den tørrede prøve vil derefter blive derivatiseret med 50 ml N-(butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluor-N-methyl-acetamid (MTBSTFA) i pyridin (1:1 v/v) ved 50oC i 2 h. Allantoin vil blive analyseret af GC-MS. Separationer udføres på en kapillarsøjle af fusioneret silica belagt med tværbundet 5% phenylmethylsiloxan (Ultra 2, Agilent, USA). Derivatiserede allantoinprøver (1 µl) vil blive injiceret i GC-MS. Kvantificering af allantoin vil blive beregnet ved sammenligning med den tunge isotop.

Til uratanalyse vil 80 ul vand blive tilsat til 20 ul plasma, blandet og derefter centrifugeret ved hjælp af Nanosep-filtre (10 kDa). Filtratet vil derefter blive injiceret i en HPLC (Agilent Technologies, USA) koblet til en UV-detektor. Kromatografisk adskillelse vil blive opnået ved hjælp af 250 mm Zorbax SB-C8 kolonner under isokratiske forhold, hvor 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95) vil blive brugt til den mobile fase. Arealet af den eluerede urinsyretop vil blive målt, og koncentrationen bestemmes mod den lineære kalibreringskurve konstrueret med prøverne tilsat rent urat.

Kliniske parametre for serum og hæmatologiske indekser

Blodglukose, HbA1c og insulin, serum hsCRP, kolesterol, LDL, HDL, triglycerid og jern vil blive målt ved hjælp af Cobas C111 analysator (Roche Diagnostics, Schweiz). Serum-zink- og kobberniveauer vil blive bestemt på referencelaboratoriet på Singapore General Hospital, og hvide og røde blodtal, hæmoglobin, hæmatokritkoncentrationer, blodplader, neutrofiler og lymfocytter vil blive vurderet ved hjælp af Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japan) .

Vaskulære indekser

Teknikken til pulsbølgeanalyse vil blive brugt til at bestemme aortatrykket og augmentationsindekset (AIx). Pulsbølgehastighedsregistreringer vil blive foretaget fra den radiale arterie ved hjælp af et Millar tonometer, og data vil blive indsamlet og analyseret ved hjælp af SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australien), som muliggjorde kontinuerlig registrering af det radiale arterietryk. bølgeform. AIx vil blive beregnet ved at dividere forskellen i tryk mellem den første og anden systoliske top af aortatrykbølgeformen med det beregnede aortapulstryk.

Måling af plasmanitrat/nitrit vil blive tilpasset fra Tsikas. Kort sagt, til 200 µl plasma-tungt mærke tilsættes 15N NO3- og 15N NO2-, 800 µl acetone og 100 µl pentafluorbenzylbromid (PFBBr) tilsættes, blandes og inkuberes ved 50°C i 60 min. Acetonedelen vil blive fordampet under nitrogen, og derefter vil 500 µl toluen blive tilsat og blandet kraftigt i 1 min. Den organiske ekstrakt opnås ved centrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter ved 4°C. Derivatiserede prøver vil blive analyseret af GC-MS/NCI. Separationerne udføres på en kapillarsøjle af kondenseret silica belagt med tværbundet 5% phenylmethylsiloxan. Derivatiserede prøver (1 µl) vil blive injiceret i GC-injektionsporten ved hjælp af en splitless-tilstand. Kvantificering af nitrat/nitrit vil blive beregnet ved at sammenligne toparealet af hver forbindelse med den relevante tunge mærkede interne standard 15N NO3- og 15N NO2-.

Statistiske analyser

Statistisk analyse vil blive udført med GraphPad Prism version 5.0 til Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA). Alle værdier vil blive udtrykt som middel SD. Parret elevs t-test vil blive udført mellem baseline og hvert tidspunkt under tilskud og efter udvaskningsperioden. Eventuelle væsentlige ændringer opdaget af Students t-test vil blive bekræftet af ANOVA med gentagne foranstaltninger for at vurdere virkningerne af zink over tid.