Suplementación de zinc en diabéticos tipo 2

Participantes del estudio

Cuarenta diabéticos tipo 2 masculinos, reclutados de la clínica ambulatoria del Hospital Universitario Nacional de Singapur, serán asignados aleatoriamente para recibir dos tabletas de 100 mg de gluconato de zinc (GNC, EE. UU.) o placebo (99 % de celulosa microcristalina, 1 % de estearato de magnesio) por día durante 3 meses. En este estudio se incluirán sujetos de 21 años o más que cumplan con los criterios de la Asociación Estadounidense de Diabetes para el diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2. Excluiremos a aquellos que: hayan consumido medicamentos de venta libre o recetados, suplementos de vitaminas/minerales o remedios tradicionales chinos, hayan sufrido una infección aguda menos de 30 días antes del inicio del estudio, hayan sido diagnosticados con enfermedad neuropsiquiátrica activa o enfermedad hematológica enfermedades, hemoglobina inferior a 10 g/dl, uso previo de estupefacientes o consumo regular de alcohol superior a 14 unidades por semana. Cada participante proporcionará su consentimiento informado por escrito antes de su participación en este estudio.

Suplementación y muestreo de sangre y orina.

Se contratará a un farmacéutico investigador del hospital para aleatorizar, cegar a los grupos de tratamiento asignados y contar los comprimidos restantes para evaluar el cumplimiento. Se tomarán muestras de sangre y orina después de un ayuno de 8 horas al inicio (antes de la suplementación), los días 3 y 7, los meses 1, 2 y 3 durante la suplementación y 1 mes después de la ingesta de zinc o placebo (lavado). Se recolectará una alícuota de sangre en tubos simples o EDTA para la separación de suero o plasma, respectivamente.

Marcadores de daño oxidativo

Las muestras de sangre recolectadas en tubos con EDTA se centrifugarán, se agregará indometacina e hidroxitolueno butilado al plasma y las muestras de orina fresca se colocarán en tubos de polipropileno. Las muestras preparadas se almacenarán a -80oC hasta su análisis. Los biomarcadores relacionados con el estrés oxidativo, F2-IsoP, F4-NP, HETE, COP y alantoína, se medirán mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas utilizando los métodos descritos anteriormente. Brevemente, isótopos pesados ​​mixtos, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (obsequio del Prof. Jason D. Morrow (fallecido), Eiscosanoid Core Laboratory en la Universidad de Vanderbilt), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 y ácido araquidónico-d8 y ácido docosahexaenoico-d5, y 7-OH colesterol-d7, 24- OH colesterol-d7 y 26 (27)-OH colesterol-d5 y 7-ceto-colesterol-d7 se agregarán al plasma para la cuantificación de los marcadores de estrés oxidativo. Para medir las formas totales (libres y esterificadas) de los productos F2-IsoPs, F4-NPs y HETEs, se agregará al plasma hidróxido de potasio 1 M preparado en metanol (1:1) y se realizará la hidrólisis a 37oC durante 30 minutos. A continuación, se añadirán secuencialmente metanol, HCl 5 M y ácido fórmico 40 mM (pH 4,6) y se mezclarán. La mezcla de plasma luego se purificará mediante extracción en fase sólida (SPE) de intercambio aniónico. Para medir las formas libres en plasma y orina (F2-IsoPs y HETEs), se añadirá ácido fórmico 40 mM (pH 4,5) a la muestra de plasma u orina, se mezclará y luego se purificará por SPE. Se medirán los niveles de creatinina urinaria para estandarizar F2-IsoPs y HETEs urinarios (Sigma Diagnostic kit, EE. UU.).

A continuación, las muestras purificadas se derivatizarán y analizarán mediante cromatografía de gases (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, EE. UU.) acoplada a un detector selectivo de masas (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, EE. UU.) (GC-MS). Para F2-IsoP, F4-NP, HETE (una mezcla de 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- y 20-HETE) y mediciones de araquidonato total y docosahexanoato total, ionización química negativa (NCI ) y las separaciones cromatográficas se realizarán en una columna capilar de sílice fundida recubierta con fenilmetilsiloxano al 5% reticulado (HP-5, Agilent Technologies, EE. UU.). Para determinar los COP, se aplicará el modo de ionización electrónica y se realizarán separaciones cromatográficas en una columna capilar de sílice fundida recubierta con fenilmetilsiloxano al 5% reticulado (Ultra 2 J&W, EE. UU.). Las concentraciones de los productos de oxidación de lípidos se calcularán comparando el área del pico de cada compuesto con el patrón interno deuterado correspondiente.

Para el análisis de alantoína y urato, se centrifugarán 25 ul de plasma utilizando filtros Nanosep (10 kDa) y al filtrado se le añadirán 25 ul de alantoína 15N 4 mM y 100 ul de acetonitrilo, se mezclarán y luego se secarán bajo gas nitrógeno. A continuación, la muestra seca se derivatizará con 50 ml de N-(butil-dimetil-silil)-2,2,2-trifluoro-N-metil-acetamida (MTBSTFA) en piridina (1:1 v/v) a 50oC durante 2 H. La alantoína será analizada por GC-MS. Las separaciones se llevarán a cabo en una columna capilar de sílice fundida recubierta con fenilmetilsiloxano al 5% reticulado (Ultra 2, Agilent, EE. UU.). Las muestras de alantoína derivatizadas (1 µl) se inyectarán en el GC-MS. La cuantificación de la alantoína se calculará por comparación con el isótopo pesado.

Para el análisis de urato, se agregarán 80 ul de agua a 20 ul de plasma, se mezclarán y luego se centrifugarán utilizando filtros Nanosep (10 kDa). A continuación, el filtrado se inyectará en un HPLC (Agilent Technologies, EE. UU.) acoplado a un detector UV. La separación cromatográfica se logrará usando columnas Zorbax SB-C8 de 250 mm en condiciones isocráticas donde se usará NH4H2PO4 2 mM (pH 2.95) para la fase móvil. Se medirá el área del pico de ácido úrico eluido y se determinará la concentración frente a la curva de calibración lineal construida con las muestras enriquecidas con urato puro.

Parámetros clínicos de índices séricos y hematológicos

La glucosa en sangre, HbA1c e insulina, hsCRP en suero, colesterol, LDL, HDL, triglicéridos y hierro se medirán utilizando el analizador Cobas C111 (Roche Diagnostics, Suiza). Los niveles séricos de zinc y cobre se determinarán en el laboratorio de derivación del Hospital General de Singapur, y se evaluarán los recuentos de glóbulos blancos y rojos, hemoglobina, concentraciones de hematocrito, plaquetas, neutrófilos y linfocitos mediante el Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japón) .

Índices vasculares

Se utilizará la técnica de análisis de ondas de pulso para determinar la presión aórtica y el índice de aumento (AIx). Los registros de la velocidad de la onda del pulso se realizarán desde la arteria radial utilizando un tonómetro Millar, y los datos se recopilarán y analizarán utilizando el SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australia), que permitió el registro continuo de la presión de la arteria radial. forma de onda El AIx se calculará dividiendo la diferencia de presión entre los picos sistólicos primero y segundo de la forma de onda de la presión aórtica por la presión del pulso aórtico calculada.

La medición de nitrato/nitrito en plasma se adaptará de la de Tsikas. En resumen, a 200 µl de marca pesada de plasma se agregarán 15N NO3- y 15N NO2-, se agregarán 800 µl de acetona y 100 µl de bromuro de pentafluorobencilo (PFBBr), se mezclarán y se incubarán a 50 °C durante 60 min. La porción de acetona se evaporará bajo nitrógeno y luego se agregarán 500 µl de tolueno y se mezclarán vigorosamente durante 1 min. El extracto orgánico se obtendrá centrifugando a 2000 rpm durante 5 min a 4°C. Las muestras derivadas se analizarán mediante GC-MS/NCI. Las separaciones se llevarán a cabo en una columna capilar de sílice fundida recubierta con fenilmetilsiloxano al 5% reticulado. Las muestras derivatizadas (1 µl) se inyectarán en el puerto de inyección del GC mediante un modo splitless. La cuantificación de nitrato/nitrito se calculará comparando el área del pico de cada compuesto con el estándar interno de marcado pesado relevante 15N NO3- y 15N NO2-.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizará utilizando GraphPad Prism versión 5.0 para Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, EE. UU.). Todos los valores se expresarán como SD media. La prueba t de Student pareada se realizará entre la línea de base y cada punto de tiempo durante la suplementación y después del período de lavado. Cualquier cambio significativo detectado por la prueba t de Student será confirmado por ANOVA con medidas repetidas para evaluar los efectos del zinc a lo largo del tiempo.